西安齐岳生物提供辣根过氧化物酶(HRP)标记前列腺素E2、前列腺素A2、氯磺隆、胆固醇、地塞米松、雌二醇、孕酮、生育酚、维生素B6、维生素A、胆钙化醇、麦角钙化甾醇、烟酸、黄素单核苷酸、核黄素、石杉碱甲、新橙皮苷二氢查尔酮、重楼皂苷、松香酸、香草酸、汉黄芩苷、辣椒碱、辣椒素、胆红素、芦丁、齐墩果酸等小分子**。

1、

1.1 lgG

1.1.1  鸡IgG重链抗血清的制备将经离子交换层析提纯的鸡lgG进行SDSPA GE。电泳后切割重链部分凝胶条，经无菌处理加入等体积的弗氏佐剂乳化﹐常规方法免疫制备抗血潜。1.3.2兔抗鸡gG抗血清的制备过离子交换层析后又经分子筛层析提纯的鸡IgG同样按常规方法免疫家兔，制备免抗鸡IgG抗血清。

1.1.2  兔抗鸡lG的提纯方法如鸡IgG的提纯。分别进行辛酸-50 %SAS 35 %SAS盐析以及过DEAE纤维素(DE52)离子交换层析柱提纯兔抗鸡IgG。经SDSPA GE检测比较2种方法提纯物的纯度。

将鸡抗Yucaipa病毒阳性血清作从2-7至212的倍比稀释，通过在 Dot-ELISA中的显色效果判定自制酶标抗体的质量。1.62

1.2  Yucaipa鸡胚尿囊毒从2‘倍比稀释至2-16，正常SPF 鸡胚混合尿囊液从2'倍比稀释至2-7。Dot-ELISA方法测试鸡IgG重链免疫与鸡IgG全分子免疫产生并制备的兔抗鸡IgGHRP酶标抗体(前者**工作浓度为1/200，后者为1/ 1 000)在检测Yucaipa鸡胚尿囊液毒时的非特异性反应情况。

2、

2.1 IgG

  由图Ⅰ可以看出，经SDSPAGE检测发现其中仍含有较多的杂蛋白未能去除,而再经33%或35%SAS处理仅能去除其中的部分杂蛋白。

  （图1）

注: 1．辛酸-50 %SAS-35 %SAS提纯鸡lgG;

2．蛋白质分子量标准;

3．辛酸-50 %SAS提纯鸡IgG;

4．辛酸-50 %SAS35 %SAS提纯鸡IgG

  由图2可以看出，经辛酸-SAS提纯的鸡IgG再过DEAE纤维素(DE52)离子交换层析柱后的鸡gG相对较纯。经Sephadex-200分子筛层析未能提高将经离子交换层析提纯所得鸡IgG的纯度。经离子交换层析提纯的鸡IgG再经20 %SAS盐析仍不能产生任何良好的效果。通过与美国进口(Sigma公司产品)的经分级沉淀及离子交换层析提纯的鸡IgG的SDsPAGE结果比较显示，本试验提纯的鸡IgG的纯度不次于进口产品。

（图2）

注：1．辛酸SAS离子交换层析提纯鸡IgG;

2.辛酸SAS离子交换层析-20 %SAS提纯鸡IgG

3.辛酸-SAS离子交换层析-Sephadex- G200提纯鸡IgG;

4.美国Sigma公司鸡IgG;

5.SAS分级沉淀-离子交换层析提纯兔gG;

6.蛋白质分子量标准;

7.SAS分级沉淀-离子交换层析提纯兔gG

2.2  IgG

离子交换层析提纯所得兔IgG的纯度明显好于辛酸SAS沉淀法提纯得到的兔IgG,这与提纯鸡IgG时的情况相同。

2.3  IgG HRP

2.3.1   不同HRP/IgG克分子比值对酶标抗体质量的影响将用鸡IgG全分子免疫制得的兔抗鸡IgG经离子交换层析提纯后﹐制备兔抗鸡IgGHRP酶标抗体。通过调整不同HRP/ IgG克分子比值获得5组酶标抗体﹐它们的HRP/IgG克分子比值分别为4.15,3.24,2.49,1.99和2.43。不同HRP/IgG克分子比值酶标抗体的显色情况见图3。

（图3）

注：1)酶标抗体HRPIIgG克分子比值A为4.15,B为3.24,C为2.49,D为1.99，E为2.43.

2)酶标抗体的稀释度A,一E为1400;A一E为1800

  可以看出，HRP/ IgG克分子比值不同对显色效果的影响并不呈必然的规律性变化。有的酶标抗体HRP/IgG克分子比值很大，显色效果却很好。

2.3.2 标记过程中HRP与NaIO。作用时间对酶标抗体质量的影响由表1可以看出，HRP与 NaIO:作用时间为20 min和16 min时,所标记出的酶标抗体的显色效果明显好于作用30min的效果。

2.3.3 辛酸SAS沉淀法和离子交换层析法提纯的兔抗鸡IgG经同一过程酶标后的比较根据表2可以看出,经辛酸SAS沉淀提纯的兔抗鸡IgG虽然在纯度上较经离子交换层析提纯的兔抗鸡IgG为差,但是由二者制备酶标抗体的质量却无明显差别。

2.3.4  鸡IgG重链免疫和鸡IgG全分子免疫产生并制备的兔抗鸡IgGHRP酶标抗体的显色效果比较从表3结果可以看出，用鸡gG重链免疫产生的兔抗鸡IgG制得的酶标抗体的显色效果，明显差于用鸡IgG全分子免疫产生的兔抗鸡IgG制得的酶标抗体。

2.3.5 用鸡IgG重链免疫与鸡IgG全分子免疫产生并制备的兔抗鸡IgGHRP酶标抗体在 Dot-ELISA间接法检测Yucaipa鸡胚尿囊毒中的应用效果比较测试结果表明,鸡IgG重链免疫与鸡lgG全分子免疫产生并制备的兔抗鸡IgGHRP酶标抗体,在检测Yucaipa尿囊液毒时的非特异性斑点产生情况基本一致,从而说明鸡IgG重链免疫产生并制备的兔抗鸡IgGHRP酶标抗体并不能解决检测Yucaipa鸡压尿囊液毒时存在的非特异性反应问题。

  离子交换层析结合起来,从人血清中提取IgG。其中DEAE纤维素(DE52)吸附去除杂蛋白的条件是pH 5.7，这与其他文献14 7~”所介绍的离子交换洗脱IgG的pH值条件(6.7～7.4)相差较大。因此在提纯鸡gG的过程中本试验只是参考了文献中的辛酸用量,其他步骤主要按文献进行。SDSPAGE检测发现辛酸50 %SAS提纯鸡IgG的纯度离免疫要求还相差很远,这与文献中的报道不同。后者用该法从小鼠腹水中提得的单抗IgG的纯度在SDSPAGE照片中显示很好,二者差别是否由提纯原料不同造成值得进一步探讨。

  我们的研究表明,经辛酸SAS提纯的鸡IgG(或兔抗鸡lgG再经DEAE纤维索(DE52)离子交换层析提纯后纯度相对较高，可以满足一些基本实验需要,如作为实验参照品、制备酶(或荧光)标记抗体等。

  本试验按文献所介绍的HRP与 NaIO。的作用时间(30 min)处理时效果欠佳。作用30 min的兔抗鸡IgG HRP的质量远远不及作用20 min与作用16 min的质量。此差别也可能由所用试剂的质量或其他方面原因造成，因此希望从事有关方面工作的科研人员注意其时间的选择和确定。

相关产品供应

zl 01.28