目前市场上基于酶底物检测方法主要是显色培养基法和荧光检测法。本文合成了一种新型半乳糖酶底物1，可以通过与气相色谱联用技术来快速检测病源微生物。酶底物1的合成路线如图1所示,以五乙酰半乳糖2为原料,经溴代,亲核取代、还原和脱保护等5步有机反应，总产率为56.1% ,高产率高选择性得到目标酶底物。

图1酶底物1合成路线。

实验

实验步骤

步骤一：1-溴-2,3,4,6-O-四乙酰基-3-D-半乳糖2的合成

步骤二：2,3,4,6-O-四乙酰基-1-O-(4-甲酰基苯氧基)-3-D-半乳糖3的合成

步骤三：2,3,4,6-O-四乙酰基-1-O-(4-羟甲基苯氧基)-B-D-半乳糖4的合成

步骤四：半乳糖缀合物5的合成

步骤五：半乳糖苷酶底物1的合成

结果与讨论

该酶底物1可被微生物分泌的半乳糖酶水解，发生断裂糖苷键释放出苷元a。苷元a化学性质非常不稳定,在缓冲液中会自发断裂释放出一分子二甲胺、二氧化碳和4-羟甲基苯酚,其水解原理如图2所示。二甲胺在室温为带有氨味的气体,通过与气体检测仪如气相色谱联用可以灵敏监测酶底物的水解动态,从而可以进一步发展为微生物检测技术。

在合成过程中,对化合物4的合成方法进行了优化,发现采用LiAIH副产物较多,KBH存在反应不完全现象，只有NaBH4和THF体系反应效果更好。化合物5的合成过程中,曾采用固体三光气做为偶联活化试剂,将二甲胺和化合物4偶联,发现反应控制较难，会有大量副产物生产，产率只有28%。故改用二甲氨基甲酰氯为反应试剂,产率大幅度提升,产率高达82%。总之,本文报道了一种新型半乳糖糖苷酶底物的合成方法,采用价廉易得的五乙酰半乳糖为起始原料,通过五步有机合成反应得到目标产物,总产率高达56.1%。合成方法具有操作简便,产率高和选择性强等优点,并对半乳糖苷酶底物1的水解机理进行了探讨,其相关生物检测部分将有待进一步研究。

图2 半乳糖苷酶底物的水解。

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Dihydrorhodamine 123, dihydrochloride salt

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二氢乙锭

CF640R Tyramide

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2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐

10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine

氯化硝基四氮唑兰

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5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐

BCIP Red

BCIP Pink

XTT 钠盐

Resorufin (high purity)

Resazurin, Sodium Salt

噻唑蓝

2,3-二(4-甲基苯基)-1H-四唑-3-鎓-5-甲腈氯化物

5-溴-4-氯-3-吲哚-Β-D-纤维二糖糖苷

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