辣根过氧化物酶(HRP)底物的研究-UDP糖丨MOF丨金属有机框架丨聚集诱导发光丨荧光标记推荐西安齐岳生物

用酶标记各种特异性配体(抗体、抗原等),利用酶的催化放大作用和特异性作用而建立的标记免疫分析叫做酶免疫分析( enzyme immunoassay，EIA) "。在酶免疫分析中将在酶催化作用下产生新化合物的物质统称为底物。一种酶能催化特定的底物,将其转化为有可检测信号的产物。酶仅使底物转化为产物,本身在反应过程中并不消耗,反复起催化作用,将信号放大。传统的EIA 采用色原底物测量可见光的吸光度,随着酶免疫分析技术的发展,出现了灵敏度更高的放射性底物、荧光底物和化学发光底物,而改为测量释放的射线、荧光和化学发光。由于采用放射性底物存在接触和处理放射性物质的危险,而随后出现的荧光和化学发光检测的灵敏度已经达到或超过该方法,因此放射性底物出现后不久即很少使用。目前常用于EIA 的酶包括如下3种:辣根过氧化物酶( horseradish peroxidase , HRP)、碱性磷酸酶( alka-line phosphatase ,AP)及β-D-半乳糖苷酶( B-D-galactosidase,CAL)。其中 HRP分子小,易于与蛋白耦联,而且呈色性好,应用广泛,因此对HRP底物的研究在基于酶的分析检测中具有非常重要的意义。本文对近年来HRP底物的研究进展作一综述。

色原底物

早期HRP底物是色原,常规的色原底物在酶作用下产生一种新的颜色(或者吸收光谱发生改变),这种检测方法的优点在于产生的颜色很容易用肉眼或光谱仪器检测,检测仪器的价格一般也比其他检测方法所用的仪器便宜;缺点是检测灵敏度普遍低于其他酶检测方法。

色原底物的基本结构可用变化多样的芳香族胺和酚表示,大多数芳香胺,酚和它们的混合物在酶促氧化时会产生有色的缩聚物。常见的芳胺类色原底物包括:邻苯二胺( OPD),四甲基联苯胺(TMB)、2,2'-连氮-双-(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、5-氨基水杨酸(5-AS),邻联二茴香胺( ODA),邻联甲苯胺(OT)等1。部分色原底物的分子结构式见图1。

图1部分色原底物的分子结构式

3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)和3,6-二氨基-9-乙基咔唑常用于过氧化物酶的活性染色。Krieg 等'将AEC连接鳌合的N-苄基部分,得到-类新型的N-芳基甲基-苯胺色原底物(通用结构式见图2)。其制备方法是将AEC或3,6-二氨基-9-乙基咔唑与芳香醛混合浓缩,随后将浓缩产物Schiff碱用NaBH,还原即可。与传统的芳胺类色原底物相比,这种新型底物的灵敏度和适用性等得到很大改进。

图2 3-(N-芳基甲基)氮基9-乙基咔唑(X=OH，NHR)

结论

HRP在酶免疫分析中占有重要地位。在前述的三类主要HRP底物中,早期的色原底物检测灵敏度不高,随后发展起来的荧光底物和化学发光底物**提高了灵敏度,但面临的共同问题是检测仪器价格昂贵,从而限制了其应用。另外这两种底物自身也都存在一些缺陷:荧光信号易饱和,易猝灭,以及自发荧光对实验结果产生干扰;化学发光必须随时采集,光积分时间长等。与之相比,纳米金底物具有-一系列突出优点:灵敏度高,纳米金颗粒的消光系数比色原底物和荧光基团高大约1000倍;检测成本低,采用电镜甚至目视即可检测;沉积金属非常稳定,使检测信号容易得到恒定值,等等。纳米金底物已经作为新型的标记探针,用于免疫组化中稀有组织抗原的高灵敏度检测。