微球载体固定化碱性磷酸酶的底物吸附现象-UDP糖丨MOF丨金属有机框架丨聚集诱导发光丨荧光标记推荐西安齐岳生物

在含一定浓度的对硝基苯磷酸(pNPP)及不同浓度的对硝基苯酚(pNP)的 DEA缓冲液中，测定了不同吸附时间下405 nm的光吸收值、从测得的p.NP浓度与光吸收值曲线(图1)看出:在含0. 6 mmol/L底物的DEA缓冲液中,微球对产物pNP在15 min内的吸附影响比在高浓度底物(15mmol/L>溶液中大得多、所得曲线严重漂移、已不呈直线．这说明微球对pNPP和pNP都有吸附作用．在测定固相酶的活力时需考虑底物浓度对光吸收曲线的影响．当加入底物pNPP的浓度为15 mmol/L时(远大于加入产物pNP的含量),灭活的载酶胺化微球对pNP仍有明显的吸附作用．而且在一定时间内随吸附时间的延长,吸附量加大.

从图1中看出，随着吸附时间延长曲线的线性关系发生变化,吸附2h后在含pNP浓度较低的溶液中微球仍有一定的吸附力;而在浓度较高的溶液中吸附已接近饱和,表现为与吸附45 min 的曲线重台,由此可见微球对pNP的吸附有个**值.

吸附时间对微球吸附pNP和pNPP也有影响．从图2看出，尽管吸附水平不同，但在溶液中不加底物pNPP与加入0.6 mmol/L和15 mmol/L pNPP的3种条件下，吸附曲线都在吸附15 min时接近饱和。吸附2h基本饱和.

微球对pNPP和pNP吸附作用的原因:一个是由于固载碱性磷酸酶所用胺化聚苯乙铎微球为交联型﹐酶分子通过戊二醛与做球表面的氨基交联，微球内部的大部分氮基在碱性溶液中形成NHOH-形式，具有一定的离子交换能力，带负电性小分子pNPP 和 pNP通过异性电荷吸引及离子交换促进吸附﹔另一个是胺化苯乙烯微球的疏水骨架与含苯环的产物和底物之间具有一定的疏水力，也促进了吸附.

载体对底物和产物的吸附导致碱性磷酸酶固定化后米氏常数减小(图3)，这是因为微球载体对底物的吸附能力影响了底物的分配效应1．分配效应以分配系数(p)来描述:p=S./S(式中S;和S分别表示底物在微环境中的局部浓度和客观体系中的总体浓度).

在消除了外扩散限制的影响后,分配效应影响改变了固相酶的的Km值(K'm一Km/p).

本文研究的载体和底物带相反电荷，p>1，从原理上讲固定化酶的K'm小于游离酶Km实验结果证实了上述推断．静电作用使微环境中底物浓度比总体浓度高，Km减小，酶催化反应的速度加快﹔另外，底物和载体间的疏水作用也会改变分散系数，使酶促反应加快.

载酶微球的吸附效应对酶催化反应也有负作用，这表现在产物积累影响催化反应上.在微球表面的酶分子催化底物pNPP转化为pNP后，pNP积累于酶分子周围，如果不能及时扩散，可能造成产物的竟争性**(．因为载酶微球对底物和产物具有吸附瑰象，会造成标准吸收曲线的漂移，所以在固相酶活力测定时要考虑这种现象对实际活力的影响．此外，载酶微球的底物和产物的吸附现象有利于固相酶在免疫检测等显色反应中的应用.

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