β一微球蛋白分子量为11.8KD,是一种相对较小的蛋白质.β一微球蛋白存在于除红细胞和胎盘滋养层细胞以外的所有有核细胞，尤其在淋巴细胞和单核细胞中含量丰富，在其免疫应答中起重要作用．资料显示,在白血病、**和其他一些患者中β一微球蛋白含量比正常人高．用双抗体夹心法定量酶联免疫吸附试验确定正常人和患者的β一微球蛋白量分界限(cut一off值),可为疾病检测建立一种方法．本文酶标二抗的制作为定量ELISA试验的一个重要环节.

主要试剂

Tris一HCl缓冲溶液(羟甲基胺基甲烷—一盐酸的缓冲溶液);Sephacryl S—300:装柱料S—300凝胶是由烯丙基葡萄糖与N,N'一亚甲基双丙烯酰胺共价交联制备的刚性凝胶等.

方法

酶标抗体的制备  其步骤如下:

1) 取0.2 M碳酸氢钠水溶液2 mL装入试管中，加入HRP20 mg 使其溶解,溶液呈褐色.

2）缓慢地加入0.06 M过碘酸钠溶液2 mL,在4℃条件下,放置1 h

3）迅速加入0.16 M 乙二醇一氯化钠水溶液2 mL，置室温下30 min.

4)加入无水乙醇24 mL，以1 500 r/ min离心30 min,弃取上清液,沉淀中加7 DW 10 mL溶解,分成两份,加入β2一微球蛋白单克隆40 mg,0.67 mL包被液在4℃下放置过夜

5）加入70uL硼氢化钠,0.33 mL磷酸二氢钠，然后上 Sephacry l S~300柱.

用蛋白纯化仪纯化酶标抗体结合物的Tris一HCI缓冲溶液加到柱长的1/4处,然后将漂洗溶胀的SephacrylS—300倾入柱中，自然沉降30min,再用同样的缓冲液平衡柱1 h,流速0.7 mL min,调节紫外检测仪和其他收集器,使收集样品的量为6.0 mL/管，加样量为50OuL.

酶标抗体检测 用定量免疫学方法(ELISA)检测各部分洗脱液的抗体

分装蛋白 将6Es,7Hs得到的蛋白质在蛋白检测仪中测蛋白质在波长260、280.320 nm 处的吸收度,根据1.45×A28o一0.74×A2so计算蛋白质的量(mg/mL),剩余蛋白质进行分装。通过检测将6Es在第4峰时的分馏物加对半量甘油,以 800 4L/支分装,共装12支,在一4℃冷冻保存．将7Hs在**,第三峰时的分馏物加对半量甘油，以800 4L/支分装,其中**峰共装19支,第三峰共装17支,在一4℃冷冻保存.

6Es酶标抗体结合物的分离纯化结果﹒

Ⅰ峰:β2-微球蛋白与过氧化物酶的结合物;II峰:未结合的物质

图1  6E，酶标抗体结合物的分离纯化

Ⅰ峰:β2一微球蛋白与过氧化物酶的结合物;II峰:未结合的物质

图2  7H5酶标抗体结合物的分离纯化图

酶标抗体结合物蛋白浓度测定结果

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