质粒构建的过程，制备方法

质粒构建简化过程（以酶切连接为例）：提取质粒——扩增目的基因片段——对质粒和目的片段进行酶切处理——连接——转化——培养——鉴定几个步骤。

质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术，原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达，可以看到我们最最需要的三样元素：目的片段、酶切载体和连接酶。质粒构建方式多样，常规的T4连接酶，下面就介绍下T4连接酶构建质粒方法，T4连接酶可用于平末端也可用于粘性末端连接，但一般推荐适用黏性末端。

1）  质粒载体制备　质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。

一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：

（1 ）选择质粒上两个酶切位点的距离不应小于太小（>10bp），否则影响限制性内切酶对切点的识别，不利于空载体的双酶切。

（2）一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：目的基因片段内部不含有所选的酶切位点（不然鉴定阳性重组子双酶切时会将目的基因切断）。

（3）实验后继应用的所有载体（真核、原核、酵母、昆虫）都尽可能含有所选的酶切位点。并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）。（不然换载体表达时，还要重新设计引物，以引进新的酶切位点）。

（4）尽可能选比较常用的酶切位点（常用切点酶的价格比较便宜）。

（5）两个酶切点至少隔上3个碱基。

（6）两个酶切点**不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

（7）**使用酶切效率高的酶。

（8）**使用双酶切有共同buffer的酶。

2）目的片段制备

这里我们主要使用PCR扩增的手段，因为我们前面的科创百科介绍过，这里就不再进行过多赘述。准备，首先要对目标片段进行扩增富集。PCR 即聚合酶链式反应，它是一种用于扩增复制特定 DNA 片段的常用分子生物学技术。PCR 的最大特点是能将微量的 DNA 大幅扩增，在克隆前获得大量的目标基因片段。利用引物设计软件如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在线设计引物并合成后，配制 PCR 反应体系：将模板、引物、dNTP、酶、反应缓冲液和 ddH₂O 按比例加入，加好后轻微点离，放入 PCR 仪中扩增目的片段，扩增后通过琼脂糖凝胶检测目的片段大小是否正确。

3）酶切连接

获得目标片段后，要与我们的质粒载体进行连接，必须借助两个工具来实现——酶切工具（限制性内切酶）和连接工具（DNA 连接酶），这里使用的内切酶在我们的片段和载体上产生的接口一定要相同，不然DNA连接酶是无法将它们连接上的。配制琼脂糖凝胶（常用浓度 1-2%）后点样，切胶电泳回收目的片段，选择合适的内切酶将目的片段和质粒载体同时切割，酶切后的片段再次电泳回收，测定浓度后按比例加入 T4 DNA 连接酶，粘性末端载体、目的片段、缓冲液，进行连接后直接转化。

4）转化鉴定

将连接产物加入感受态细胞（常见的感受态细胞：TOP10、DH5α、BL21，他们可是转运过程的小能手，负责质粒的克隆和表达，这里下期科普百科会详细介绍），冰上放置30min、42°C 热激转化或电转化，加入无抗性 LB 培养基，200rpm -37°C 摇床摇 45-60min 后，涂至抗性或者其他筛选平板上，37°C 培养过夜、挑取 3-5 单个克隆摇菌、菌落 PCR 或提取质粒后酶切鉴定、鉴定完毕后送质粒或菌液测序验证。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

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