质粒构建的原理、步骤|质粒构建定制服务

质粒（plasmid），通常被定义为圆形的、双链的染色体外DNA。我们知道，每个细胞都有一个细胞核或核区域，包含了细胞的所有遗传物质。但原核细胞，和一些真核细胞，拥有额外的DNA，从他们的核区域的DNA分离。这个额外的DNA被称为质粒。它是双股的，通常是圆形的，这意味着它连接在一起形成一个圆。

质粒构建的原理外源 DNA 经 PCR 扩增后，用限制性内切酶分别切割载体和外源 DNA 片段，DNA 连接酶将二者进行连接，然后转入宿主细菌，通过筛选鉴定获得重组克隆。经过一系列的操作，「快递员」质粒就完成了呈递目标片段的工作。

质粒构建的步骤

PCR 扩增

PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。以单链DNA为模板，4种dNTP为底物原料，在引物引导的情况下，模板与底物通过DNA聚合酶的聚合延伸，多次重复后使DNA呈指数扩增复制。

PCR的原理

变性：是利用DNA在体外高温时变性，双链解离变成单链；

退火：低温时引物与单链DNA按碱基互补配对原则结合；

延伸：再调温度至DNA聚合酶**反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5’- 3’)的方向合成互补链。

将这三个步骤重复（“循环”）25-35次，即可按指数方式获得精确的目标DNA拷贝。

酶切酶连

获得目标片段后，必须借助两个工具来实现，酶切工具（限制性内切酶）和连接工具（DNA 连接酶）；

实验中遇到双酶切，经常会出现分开酶切费时费力（步骤繁琐），酶切时间长，产生星活性等问题；而双酶切也有可能（缓冲体系和**温度不同）产生酶切不完全现象。选取可保证两种酶活性的缓冲液是关键，既保证酶切效率又可以避免酶切过久。

转化鉴定

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

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