Crispr/Cas9操作步骤

CRISPR/Cas9系统基因敲除个别外显子（操作步骤）

由于Crispr/Cas9系统应用为广泛，可以实现基因编辑，完成基因的敲除/敲入，还可以进行基因表达调控和剪辑替换。

1、确定目的基因及序列

2、基因组靶点的重要特征包括：长度大约为20个核苷酸；序列带有PAM序列

3、设计gRNA：不包含PAM序列；可以是基因组DNA的任一条链；对于基因组破坏，gRNA靶定的位点应靠近蛋白编码区的N端，以便增加基因破坏的可能性

4、sgRNA的设计要求：

Cas9会在目标DNA上切开双链，如果把其中一个核酸酶活性位点突变掉，它就变成了一个切口酶。用一对这样的sgRNA把这种切口酶带到基因组上的特异位点，这样就大大提高了靶向的特异性。

1）长度一般应为20nt 左右

2）对于sgRNA序列的碱基组成，可选3'末端含GG的sgRNA，同时sgRNA 种子序列尽量避免以4 个以上的T结尾，GC%含量为40%~60%

3）sgRNA的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低

4）如果构建U6或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，以提高其转录效率

5）对于sgRNA靶向基因的结合位置，如需造成基因移码突变，需尽量靠近基因编码区的ATG下游，位于**或第二外显子

6）检查sgRNA靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs

7）如采用Cas9单切口酶，设计paired-gRNA需考虑成对sgRNA的间距

8）全基因脱靶效应分析，需考虑脱靶位点大允许几个错配碱基数，建议少5个碱基。重点考察种子序列和非种子序列碱基错配数，以及脱靶位点是否位于基因编码区等，另外还可考察是否存在碱基插入或缺失的脱靶位点

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

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