质粒构建的原理及方法

质粒(Plasmid)

质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子；一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用；它是基因工程**的运载体。

一、质粒的构建方法：以sgRNA为例

1、酶切载体

LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点，通过使用BsmB内切酶I，我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书，随后进行胶切、回收并备用。

2、寡核苷酸链引物退火

体系：

退火参数：

37℃ 30 分钟，95℃ 5 分钟，然后以每分钟降低5℃的速度将温度降到25℃

3、连接

体系：一般室温放置20-30分钟（NEB的快速T4连接试剂盒）

4、质粒转化① 从-80℃存储的Stbl3感受态细胞中取出并解冻，将5-10µL连接产物轻柔吹混匀后加入感受态细胞，接着在冰上孵育30分钟

② 冰上孵育后，将感受态细胞放入预调至42℃的水浴锅中进行90秒的热激，然后返回冰上孵育10分钟

③ 加入500 μL预热至室温的LB培养基，将混合物置于37℃摇床中摇菌30分钟

④ 以3000 r/min离心3分钟，弃掉上清，利用冷却至室温的玻璃棒涂布培养皿（AMP抗性），随后在37℃培养箱中过夜生长

⑤ 挑取单克隆，摇菌，菌落PCR

⑥ 对PCR生成物进行琼脂糖凝胶电泳，运用凝胶成像仪进行成像，并挑选阳性菌落将其送往测序公司进行测序鉴定

⑦ 基于测序结果挑选目标菌落进行扩大培养，提取质粒以备用于后续实验室实验

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

请按照相关文献和相关安全规定进行操作，避免误用或滥用。如有侵权，可联系我们删除