基因点突变细胞株技术流程-CRISPR/Cas9技术

CRISPR/Cas9系统广泛应用于多种细胞基因突变细胞株的构建：其中包括了细胞基因单点突变和多带你突变，还有例如动物细胞定点突变的流程比较服务，如何快速高效构建自己的基因突变细胞株是很多人关心的问题。但是，实验时我们往往发现，很难获得细胞点突变的纯合克隆或者杂合克隆，预期的定点突变经常伴随着等位基因的非特异性随机插入、缺失或其他突变，导致克隆的阳性率往往徘徊在1%以下。

点突变成功率低下是由于细胞的DNA损伤修复机制导致的，在哺乳动物中Cas9-sgRNA与基因组目标序列形成三元复合物之后，Cas9的两个DNA酶结构域可以切割 DNA的磷酸酯键，**形成双链断裂损伤 (DSBs)，DSBs会激发细胞本身的两种 DNA损伤修复机制，同源重组修复 (HDR) 机制和非同源重组末端直接连接(NHEJ)修复机制。一般而言，基于同源序列的精确敲入的效率远远低于NHEJ诱导的靶向插入。因此，基因定点突变虽然为各种科研工作所需要，但这项技术始终具有很高的技术门槛，成为开展基因功能与机制深入与研究的拦路虎。

HDR修复主要是在内源或者外源同源供体DNA存在的情况下对DSB进行修复，使用人工设计的外源的单链（例如ssODN）或者双链供体 DNA可以对目标靶序列进行DNA序列的敲入和辅助大片段敲除，或者构建点突变。NHEJ修复途径不依赖同源重组方式，而是在相关蛋白的介导下双链断裂直接连接修复，但是在修复过程中会产生插入缺失突变。

提高点突变实验成功率的3个步骤：

（1）引入同义突变，防止Cas9-sgRNA的二次切割

（2）优化切割位点到突变位点的距离

（3）通过优化距离提高纯合或者杂合的偏向性。

产品：

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠

CRISPR/Cas9技术构建小鼠癌症模型

Crispr/Cas9技术在CHO细胞中基因敲除

CRISPR/Cas9系统介导的地衣芽孢杆菌基因敲除

利用CRISPR-Cas9技术构建微小核糖核酸-551b基因敲除小鼠模型

CRISPR/Cas9技术构建 miRNA-29 b1基因敲除小鼠

利用CRISPR/Cas9技术制备基因敲除鼠

CRISPR/Cas9系统介导Slc6a6基因敲除大鼠

利用CRISPR-Cas9技术构建基因敲除小鼠胚胎干细胞系

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