基因的体外定点突变型质粒构建

基因的体外定点突变是常用的分子实验技术，主要用于研究蛋白质结构与功能关系或者验证 microRNA 与靶基因是否结合。今天为大家介绍下基因突变质粒的构建原理与方法。

突变型质粒构建

在得到野生型质粒之后，下一步就是对目的基因片段进行突变啦，即将目的基因上面的一个碱基或多个碱基换成另外的碱基。

质粒突变的原理: 即通过设计引物, 并利用 PCR 将模板扩增出来, 待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过 PCR 扩增得到的质粒不会被甲基化。

这样用甲基化酶 DpnI 酶处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过 PCR 扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。

1．突变引物设计: 向质粒进行单点或者多点突变，只需要设计一对引物，进行 PCR 的扩增，替换掉野生型基因的突变位点碱基。

(1) 通常突变引物长度为 25~45bp, 一般都是以要突变的碱基为中心, 各加上两边的一段序列, 两边长度至少为 10–15bp，同时合成反向互补的引物。

(2) 设计引物时好将突变引物设在目的基因的中央位置。

(3) 设计引物时需要注意 GC 含量应大于 40%，Tm 值至少达到 78℃。

2．突变质粒的扩增：突变质粒的扩增过程中，需要选用高保真酶 Pfu 酶进行质粒扩增, 防止引进新的突变。通过 PCR 过程，突变型质粒也得到了扩增。

3. 得到 PCR 产物后，将产物立即置于冰上，然后在 PCR 反应体系中加入 1 微升 Dpn I，混匀后 37℃孵育 1-2 小时。DpnI 能够识别甲基化位点并将其酶切。从大肠杆菌里提取原始质粒模板一般都被甲基化的，DpnI 可以将原始野生型质粒模板进行酶切, 而质粒扩增的突变型质粒不能被酶切从而保留下来。

4. 后，将酶切后产物转化入大肠杆菌，通过涂板挑取单克隆菌落后，摇菌测序，这样就可以得到突变基因的质粒啦。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

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