野生型质粒构建，基因的体外定点突变

野生型质粒构建

1. 引物设计：根据需要验证的基因序列，设计需要扩增的基因片段引物。引物设计方法如下：

（1）引物 F：5’ 端 - 保护碱基序列 + 限制性内切酶 1 酶切位点序列 + 基因正向引物序列 - 3’端

（2）引物 R：5’ 端 - 保护碱基序列 + 限制性内切酶 2 酶切位点序列 + 基因反向引物序列 - 3’端

通过加入基因组 DNA 模板以及设计好的引物进行目的基因的扩增，得到 PCR 产物后进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，然后通过胶回收，获得纯化目的片段产物。

由于加入保护碱基，回收产物需要进行限制性内切酶切从而暴露黏性末端。

2. 线性化质粒：将原始的质粒载体，比如 pcDNA3.1 质粒，选择合适的酶切位点，比如 NheI/KpnI 进行酶切，获得线性化的质粒。

酶切体系一般选择 50ul，试剂加好之后 37°C 孵育 6~8 小时，或适当延长时间，保证质粒酶切完全。每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切后载体通过切胶回收线性化载体。

3. 质粒连接：将线性化的载体与目的基因的连接，推荐在 10~20μl 反应体系中进行连接反应，可以选择 T4 酶进行黏性末端的连接。

4. 转化涂板：将连接产物转化到受体菌中（一般为 DH5a），涂板，培养过夜。次日，挑取平板上单克隆菌落进行摇菌, 送菌液测序，得到野生型质粒。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

点突变细胞构建

构建定点突变疾病模型

修复细胞基因中的突变

质粒点突变

点突变质粒

定点突变服务

单一突变服务

突变文库服务

哺乳动物细胞点突变

ESC或iPSC干细胞点突变

RNP法点突变

先导编辑点突变

单点、多点突变（替换、插入、删除或截断）或随机突变

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

请按照相关文献和相关安全规定进行操作，避免误用或滥用。如有侵权，可联系我们删除