通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减，慢病毒载体的发展过程

慢病毒（lentivirus , LV）是目前细胞及模式生物实验中非常有效的工具，在基因转染方面有着许多独特的优势，，在构建HIV-1型病毒载体时一般将HIV-1基因组分装于几个质粒载体中，再共转染细胞，然后获得只有一次感染能力而无复制能力的HIV-1载体颗粒。到目前为止，慢病毒载体的设计大约经历了以下几个阶段。

1）两质粒系统

以HIV-1为骨架，将其中的反式作用蛋白基因序列去除，然后包装成为含有目标基因的重组质粒和能够反式提供病毒颗粒所需蛋白的包装质粒，共转染包装细胞（如293T细胞）进行包装。两质粒系统为复制缺陷型载体，仅能获得较低的滴度，且仅能感染CD4+的靶细胞，并存在产生野生型HIV的严重危险。

2）三质粒系统

将HIV-1基因组中负责包装，逆转录和整合所需要的顺式作用序列结构和编码反式作用蛋白的序列分离，再克隆到三个独立的质粒中，并去除了所有的辅助序列。极大地增加了病毒的安全性，是目前比较常用的慢病毒包装系统。三质粒的结构如图3所示。

◆  包装质粒（Packaging plasmid）：含有CMV启动子，控制gag，pol，tat，rev基因的表达，编码部分结构蛋白和调节蛋白。

◆  包膜质粒（Envelope plasmid）：含有表达水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因的序列，这个基因用于代替原病毒的env基因，这个基因的产物，可以提高病毒的宿主范围。

◆  载体质粒（Transfer plasmid）：其中含有病毒LTR以及研究人员所感兴趣的基因序列结构。不过需要注意的是，载体质粒的表达依赖包装质粒中tat基因的启动。

4）四质粒系统

四系统是在三质粒系统的基础上改进而来的，也是目前较为常用的病毒系统。与三质粒系统相比，第一个变化是将rev基因放在一个单独的表达质粒上，新增一个质粒更增加了系统的安全性。第二个变化是将tat基因去除，并在载体质粒上增添了与异源启动子融合的嵌合5'LTR，以启动载体质粒的表达。这样就形成了四个质粒的系统，即pGag/Pol、pRev、pVSV-G。此外，还有一个可以放置目的基因序列的载体。这个体系意外产生活性病毒的可能被大大降低。四质粒的结构如图4所示。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

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