miRNA过表达稳定细胞系的构建方法

1. 选择合适的细胞系

构建miRNA过表达稳定细胞系的第一步是选择合适的细胞系。这取决于研究的目标。常用的细胞系包括HEK293T、HeLa、MCF-7等，这些细胞系容易转染并能够稳定表达外源基因。

2. 构建表达载体

miRNA过表达的关键在于构建合适的表达载体。常用的载体包括pcDNA3.1、pEGFP-C1等。这些载体一般通过克隆技术将感兴趣的miRNA序列插入载体中。首先，可以通过PCR扩增所需的miRNA前体（pre-miRNA）序列，再通过酶切连接到载体中。

3. 转染细胞

构建好的表达载体需通过转染的方法导入宿主细胞。常用的转染方法包括：

• 脂质体介导转染：常用的试剂有Lipofectamine 2000、X-tremeGENE等。

• 电转：相比脂质体转染，电转可在短时间内 Efficiently 转入较大的DNA分子。

• 病毒转导：使用慢病毒或腺病毒等载体可实现更高效的转导和稳定表达，尤其在难以转染的细胞系中尤为有效。

4. 选择阳性细胞

在转染后，通常会用抗生素进行筛选，选择成功整合了miRNA表达载体的阳性细胞。常用的抗生素包括G418、Puromycin等。经过筛选后，可以通过PCR或Northern blot等方法验证miRNA的过表达情况。

5. 功能验证

稳定细胞系构建后，需要进行功能验证，确保过表达的miRNA在细胞中的生物学功能。通常通过以下几种方法进行验证：

• qPCR：检测miRNA的表达水平。

• Western blot：验证miRNA靶基因的表达水平。

• 细胞功能实验：包括增殖、迁移、凋亡等实验，从而评估miRNA的生物学效应。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

STAT3过表达质粒载体

pcDNA3.1-cathepsin B质粒

pSilencer2.1-cathepsin B质粒

人RNF20基因过表达质粒

过表达Abba1重组表达质粒

Ifi47的过表达质粒

多肽P18(SAP18)过表达质粒

miR-122过表达质粒载体

SNCA基因过表达质粒

SNCA基因过表达慢病毒质粒构建

TPX2基因过表达质粒

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

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