DEK shRNA慢病毒质粒的构建及鉴定

DEK shRNA慢病毒质粒的构建及鉴定：按照RNA干扰序列设计原则，设计并合成针对DEK基因shRNA的两段寡核苷酸序列，分别将合成的oligo退火处理形成双链寡核苷酸，与经Agel和EcoRI双酶切的shRNA表达载体pLKO.l-puro连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单可隆提质粒进行酶切及测序鉴定。

慢病毒包装：将293T细胞终于6孔板，转染时密度约为80%，转染前2h换为无血清培养基，实验分组：

（1）阴性对照组：不含shDEK的pLKO.1空载；

（2）KD1组：包装pLKO.1-sh hDEK1重组质粒；

（3）KD2组：包装pLKO.1-sh  hDEK3重组质粒；

（4）绿色荧光蛋白对照组：包装含GFP的空载体，表达荧光，作为慢性病毒包装效率的对照。

慢病毒感染肝癌细胞：将肝癌细胞Bel-7402、Huh7接种于6孔板，分别设置以下分组：

（1）空白对照组：仅含Bel-7402、Huh7细胞；

（2）阴性对照组：感染pLKO.1空载慢病毒；

（3）KD1组：感染pLKO.1.1-sh hDEK1重组慢病毒；

（4）KD1组：感染pLKO.1-sh hDEK3重组慢病毒。细胞融合至50%左右，配制DMEM：病毒液=1:1，细胞换液。连续培养24h后更换为完全培养基，继续培养48~93h后加入嘌呤霉素连续筛选2周左右后验证敲低效率。

4、CCK-C8检测细胞增值：收集感染后细胞，以2×103个/孔接种于96孔细胞培养板中，每组6个复孔，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，分别于12、24、48h和72h向每孔中加入CCK8试剂10ul，继续孵育1h，酶标仪测定在450nm波长处各组的吸光度（A值）。实验重复3次。

5、统计学方法：所有数据以均数表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，两样本均数间比较采用t检验，多样本均数间采用单因素方差分析，P<0.05被认为差异有统计学意义。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

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