您当前所在位置:首页 > 资讯信息 > 新品上市
点突变细胞模型构建,定点切割DNA/同源重组修复DNA/阳性细胞筛选
发布时间:2024-12-17     作者:axc   分享到:


点突变细胞模型构建,定点切割DNA/同源重组修复DNA/阳性细胞筛选

构建细胞点突变模型的理论基础是基因的同源重组修复。当细胞基因组DNA双链由于外部因素而断裂时,细胞中存在着一种DNA修复机制就会被激发,对断裂位点的DNA双链进行修复,根据修复方式的不同可分为同源重组修复和非同源重组修复。顾名思义,同源重组是指DNA在修复的过程中以同源的DNA序列作为模板完美修复,而非同源重组修复是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来,同时可能会随机引入新的碱基。根据这个理论基础,点突变细胞系的构建分为三个部分:

1.定点切割DNA
在这个过程中,CRISPR-Cas9技术发挥了极大的作用。可以通过人为设计sgRNA,并将Cas9蛋白与sgRNA一起转染到目的细胞中。在sgRNA的引导下,Cas9蛋白对靶位点处的DNA进行切割,产生DNA双链断裂。


2.同源重组修复DNA
细胞内的基因组DNA产生了双链断裂后,同时引发了细胞内的DNA修复机制。因此,为了使DNA在修复过程中能通过同源重组的方式修复DNA并引入突变位点,需要为细胞提供额外的同源修复模板。这个模板的本质是人为合成的DNA序列,由5’端同源臂、突变位点和3’端同源臂组成。这种同源模板序列是随sgRNA和Cas9蛋白一起转染进细胞的。

3.阳性细胞筛选
这部分是细胞模型构建的关键部分。对于点突变模型来说,由于没有引入抗性基因,常用的方法便是通过稀释法将细胞池细胞稀释转移到96孔板中,形成单克隆细胞。然后收集单克隆细胞进行大量测序,以得到预期的纯合子细胞。

下图表示使用定点诱变将2个新的错义变体引入含有野生型ALDH5A1 cDNA 19的pAD1/RSV载体中。通过蛋白质印迹和逆转录PCR(RT-PCR)确认HEK293细胞中2个错义琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)等位基因的成功转染。

点突变细胞模型构建,定点切割DNA/同源重组修复DNA/阳性细胞筛选

定制服务

点突变细胞构建

构建定点突变疾病模型

修复细胞基因中的突变

质粒点突变

点突变质粒

定点突变服务

单一突变服务

突变文库服务

哺乳动物细胞点突变

ESC或iPSC干细胞点突变

RNP法点突变

先导编辑点突变

单点、多点突变(替换、插入、删除或截断)或随机突变


西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括:

(1)过表达质粒构建;

(2)诱导基因的定点突变;(单碱基突变,多碱基突变)

(3)构建基因截短体质粒;

(4)亚克隆质粒构建;

(5)通过慢病毒介导的基因过表达;

(6)通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

(7)通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除


注意事项:

本产品仅供科研使用,严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品,避免直接接触皮肤和眼睛。

请按照相关文献和相关安全规定进行操作,避免误用或滥用。如有侵权,可联系我们删除


库存查询