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丙型肝炎病毒F蛋白反式激活蛋白2基因在酵母细胞中的表达

发布时间：2021-03-25 作者：zzj 分享到：

丙型肝炎病毒(HCV)是世界范围内慢性病毒性肝炎的主要病原之一,约有1.7亿人被感染,常导致严重肝病,包括肝硬化和肝细胞**(HCC) 1HCV的基因组含有一个长的开放阅读框架( ORF),编码一个约3 010个氨基酸残基( aa)组成的多蛋门,该多蛋白被细胞和病毒蛋白酶切割产生至少10个病毒基因产物:核心蛋自( core:).E1 、E2 、 p7, NS2 , NS3 , NS4A,NS4B , NS5A和 NS5B蛋白等2。F蛋门是 HCV基因组[ RNA 的核心蛋白编码序列表达了1个17 kD的蛋白。关于其功能研究较少。我们利用**性消减杂交( suppression sub-tractive hybridization , SSH)技术,对于表达HCV F载体转染的HepG2细胞进行研究,阐明了F蛋白反式激活的部分靶基因,同时我们结合生物信息学( bioinformat-ics)技术克隆了F蛋白反式激活的新型靶基因,即丙型肝炎病毒F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2)基因。为了进一步研究此蛋白与人体细胞的相互作用,我们在酵母细胞中表达了HCV FTP2基因。

材料与方法

一.材料

HepG2细胞及感受态大肠杆菌DH5 α,c-myc单克隆抗体,ATCC的1-9E10.2杂交瘤产生。辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgC。酵母细胞AH109、载体. pC-BKT7及酵母YPD培养基、SD/ - Trp、- Leu等培养基。Taq DNA聚合酶。T4 DNA 连接E,EcoRI和 BamHI 。内烯既胺.N，N'-亚华双山烯酰胺.异丙基硫代-j-D-半乳糖(1PTG)及X-3-Gal及pGEM-T载体。TEVED 。醋酸肛.半硫酸腺苷。

二.HCV FTP2基因的扩增

根据电子拼接的基树序列,在编码区的土游和下游分别设计合成一对寡聚核苷酸引物(PI5'-GAA TTCATG GCA GGT CCA GAA AGT-3`和P2 5 '-GGA TCC TTATGT TGC TTT CACAGC-3 '.在引物的两端引人了 EcoRI及BamHI随切位点,引物由上海生工公司合成。在0.5 mL的Eppendorf 管中依次加入17.3 pL双蒸水.2.5;山L的10×缓冲液(含 20 mmol·L.' MgCl, ) .2 pl 2.5mmol-1.'dVTP. 1 ,.l 10 ;.mmol ·I. ' P1 , l ,l 10 pimmol ·L-' P2. 1 ,ul cDNA模板.0.2;l Taxq DNA聚合酶(5× 105U·L-'),放入PE9600 PCR役中扩增。扩增条件:94℃变性35 s,58℃退火35 s.72℃延伸 45 s,循环35次后,72℃保温10 min。20 g·l.'琼指糖凝胶电泳鉴定扩增结果,

三.pGBKT7-HCV FTP2的构建与鉴定

将经玻璃奶回收、粉/瓢仿抽提.乙醇沉淀的上述PCR反应产物与pGEM-T载体按3:l mol./L.混合,在16℃用 TDNA连接商连接过夜,随后转化入用氯化钙法制备的大肠杆菌DH5α感受态细抱.在铺有IPTG;及5-澳-4氯-3呜噪-3-D-半乳糖干(X-3-Gal)的氨苄西林琼脂糖平板上进行蓝白菌落筛选,挑取自色菌落用碱裂解法提取质粒DNA进行梅切鉴定及测序,证明 HCVFTP2基因已被克隆进T载体。该质粒及pGBKT7;均用 EcoRI及BamH两切,在T载体上释放的HCV FTP2基因用上述相同的方法连接到pGBKT7载体中,转化后接种于卡那霉素平板上,随机挑收平板上生长的菌落,碱裂解法抽提质粒DNA,双醇切及PCR 鉴定。

四、HCV FTP2在酵母细胞中表达

转化酵母细览AH09并长达州醋酸法转化,转化后铺板于SD/-Trp进行筛选。挑取2 mm 、3 mm大小的菌落过夜培养后、提取存母蛋自质。表达产物的十二烷基奭酸钠聚丙烯-酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和!Westernblot免疫印迹分析均按常规方法进行。由于在酵母表达载体pGBKT7的多克隆位点前带有人c-myc的标签,我们所表达的融合蛋白亦带此标签,因此用抗人c-mye单克隆抗体与之进行免疫反应。

实验结果

一、载体构建

HCV FTP2基因的扩增和lpGBKT7-HCV FTP2重组质粒的构建(图1)。

图IpGBK17-HCV FTP2质粒图

二、pGBKT7-HCV FTP2质粒酶切鉴定

利用自行设计的引物Pl/P2成功扩增出 HCVFTP2基闪片段,PCR产物经20 g.1~'琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增片段约177 bp,预期片段符合,且无非特异扩增现象。用PCR扩增HCV FTP2基因测序结果显示序列王确。用双酶切所得片段,连接到用相同的EcoRI及 BamHl 所切的pGBKT7中经酶切鉴定所获结果正确(图2)。

图2pGBKT7-HCV FTP2 EcoRI 及 BamHI 酶切鉴定

由此表明HCV FTP2基因已正确克隆人熊母表达载体 pGBKT7 中 , pGBKT7-HCV FTP2质粒构建成功。

三、pGBKT7-HCV FTP2质粒转化酵母AH109株

用醋梭锂法转化能母后在SD/-Trp培养基上筛选生长。山于AH109株为色氨酸营养缺陷,质粒pG-BKT7中带有色氨酸基因,转化成功的AH109可以在缺少色氨酸的培养基上生长。培养数天后,挑取一菌落进行PCR扩增HCV FTP2基因。结果显示转化成功(图3)

四、表达产物的SDS-PAGE和Western免疫印迹分析

提取未转化质粒与j转化了质粒的辞母蛋自质,进行SDS-PAGE和lWesternblot统绞印迹分析结果(图 43结果显示对照无表达而转化了pGK77-HCV FTP2的酵f母蛋白提取物Western blut印迹分析可见明显条带且无杂带。

图3pGBK17-HCV FTP2菌落进行PCR鉴定

图4HCV FTP2 Western blotting分析1道是HV FTP2蛋白.2道是阳性对照转化PCBKT7空载体,3未转化质粒

F蛋白是一个新鉴定的HCV基{国产物 3-5。编码F蛋白的开放阅读框与核心蛋门的编码序列重叠，是翻译过程中核糖体阅读框发生-2/＋!位漂移产生的,与核心蛋自具有相同的N-端序列。下蛋白与核心蛋白.NS5A相似,亚细胞定位于内质网5-91,但显示比核心蛋白有更多的序列差异性,核心蛋自的突变导致患者逃避宿主免疫反应,可能触发了细胞的恶性转化。核心蛋门的某些功能是否是F蛋白的作用,F蛋白是否调控HCV RVA的复制,是否参与病海的形态形成及在病毒生命周期中调节细胞功能是否发挥重要作用、尚不清楚。为进一步研究f蛋自的功能,明确F蛋白

在丙型肝炎发病机制中的作用,我们构建酵母双杂交表达载体并在熊母细胞中表达了HCV FTP2基因。

辞母是一种低等真核生物,与原核细胞相比在翻译加工方面其有明显的优点,例如蛋白质中二硫键的**形成.糖基化,磷酸化.寡聚体的形成等。另外,他比哺乳动物细胞操作简便,容易培养,因此酵母细胞作为一种真核基因的表达系统有着良好的前景。我们为了研究HCV FTP2的作用,克隆了HCV FTP2基因,把HCV FTP2基因在酵母表达载体pGBKT7中与c-myc标签基因片段及DVA结合域(GAlA:.1s7,氨基酸基因)基国在酵母表达载体中融合成功并且表达,在Westernblot免疫印迹分析时用其标签单克隆抗体检测到大小符合融合蛋自大小的蛋白质.说明HCV FTP2融合蛋白在酵母中表达成功。表达产物存在于酵母细胞内。随着基因组计划的完成,以后的研究进入了后基因组和蛋自质组阶段, pGBK17 - HCN FTP2酵母双杂交融合蛋白“饵”表达系统的建立,为研究HCV FTP2与细胞内蛋自的相互作用奠定了基础,对深入了解HCVFTP2的结构与功能以及在人体中对宿主细胞的作用提供帮助。

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