Ab-PROTAC偶联物是将PROTAC选择性递送至特定细胞的一种方法。抗体-**偶联物（ADC）可以将毒素特异性地传递给**细胞，大程度减少毒副作用。ADC还可以增强曲妥珠单抗（Herceptin）或培妥珠单抗（Perjeta）等单克隆抗体的，然而由于ADC固有的局限性（例如被非靶向细胞摄取），**只有少数ADC获得FDA批准。ADC发展面临的主要挑战与剂量限制性毒性（DLT）有关，即功效与脱靶毒性之间难以平衡。ADC的另一个缺点是实际传递到中的**剂量很少，这意味着**分子必须具有**的细胞毒性，这可能会导致毒副作用。由于PROTAC具有催化性进而较低剂量便可降解目标蛋白，因此PROTAC可能是ADC的理想负载。

采用曲妥珠单抗-PROTAC偶联物可以实现PROTAC的组织选择性递送，并在HER2阳性细胞中选择性降解目标蛋白。偶联物将特异性结合HER2/neu受体，通过内吞进入细胞后被溶酶体分解释放出活性PROTAC（见图1A）。鉴于BRD4是炎症和**症的潜在靶标，探索了****细胞模型中利用曲妥珠单抗和PROTAC偶联物实现特异性细胞类型中BRD4降解的潜力。

本文**选择BRD4降解剂MZ1的类似物PROTAC 1进行概念验证研究（图1B）。据报道100 nM MZ1处理细胞4小时后便可实现BRD4的完全降解，这种类型的PROTAC由BET的配体JQ1和VHL的配体组成。

**制订了通过叠氮和炔的环加成反应将PROTAC和曲妥珠单抗偶联的策略。利用化合物1的VHL配体部分上的游离羟基来结合叠氮端的PEG生成叠氮功能化的PROTAC，该羟基对于VHL的结合不可或缺，因此结合将PROTAC活性直到被溶酶体水解后才能生成活性的PROTAC。之后还原曲妥珠单抗的二硫键并与化合物13反应生成炔基功能化的曲妥珠单抗并将反应物在pH 8.5缓冲液中孵育过夜使其水解为具有血清稳定性的马来酰胺酸，后通过炔基官能化的曲妥珠单抗和叠氮-PROTAC 2之间的反应获得具有可控载荷和具有血清稳定性的Ab-PROTAC 3偶联物，从而确保了偶联物仅可通过酯基的水解释放PROTAC。Ab-PROTAC 3偶联物的合成由于没有采用铜（I）催化而排除了铜（I）的副作用。LC-MS分析显示了偶联物的成功合成，ELISA证实了抗体结合后活性仍完全保留。此外作者还是发现Ab-PROTAC 3具有稳定性：在37摄氏度pH 7.4的PBS中孵育4小时后仍有98.8％均保持完整结构，在孵育24小时后结构完整的偶联物仍高达83.5％（见图1E）。

基于细胞系中HER2/neu受体和BRD4的表达水平（见图2A、2B）和在测试相同条件下细胞系中游离PROTAC 1降解BRD4的能力（图2C），研究者选择了两种HER2阴性****细胞系（MCF-7和MDA-MB-231）和两种HER2阳性****细胞系（SK-BR-3和BT-474）来检测Ab-PROTAC 3的生物学活性。HER2 +和HER2-表型中，PROTAC 1对BRD4的降解差异性可能与细胞系中BRD4的表达差异有关。每种细胞系均用PBS、抗体（曲妥珠单抗）或阳性对照4（图2E）或不同浓度的Ab-PROTAC 3处理，并将BRD4降解剂4对BRD4的降解量作为阳性对照。认识到Ab-PROTAC 3在生理pH下稳定，作者在无血清培养基中用Ab-PROTAC 3处理细胞4小时或在处理1小时后将偶联物除去再培养23小时。

WB分析（图2D）表明Ab-PROTAC 3仅选择性降解HER2+细胞中的BRD4，而对HER2-细胞中的BRD4无影响。用100 nM Ab-PROTAC 3处理细胞4 h，仅在HER2+细胞系中观察到了BRD4的完全降解（50 nM也能观察到BRD4显着降解），而在任何测试浓度下HER2-细胞系均未观察到降解。此外，用Ab-PROTAC 3处理HER2+细胞1小时后除去Ab-PROTAC 3继续孵育23小时也观察到了BRD4的显着降解，这表明偶联物在1小时的期内已充分进入到HER2+细胞中并被溶酶体分解产生了剂量的PROTAC 1。由于Ab-PROTAC 3对缺少HER2/neu受体表面的细胞不能进行HER2/neu介导的内化，因此没有观察到降解。应该注意，在用曲妥珠单抗处理细胞的任何实验中均未观察到BRD4降解。这些实验结果证明了HER2/neu介导的抗体-PROTAC偶联物能选择性传递PROTAC。

接下来，进一步探究Ab-PROTAC 3是否通过蛋白酶体诱导BRD4降解，在使用/不使用蛋白酶体剂硼替佐米（BTZ）的情况下，将细胞与PBS、阳性对照4或100 nM Ab-PROTAC 3孵育后将细胞裂解，WB显示了蛋白酶体剂可阻止两种HER2+细胞系中Ab-PROTAC 3介导的BRD4降解（图2F）。

受体介导的抗体内化已通过不同方法进行了广泛研究，包括放射标记、荧光显微镜、流式细胞术或细胞毒性测定。其中，使用荧光标记抗体的共聚焦显微镜可以对抗体在不同细胞区室（例如内体或溶酶体）进行定位。先前有研究报道使用这种方法确定曲妥珠单抗的内化和细胞内区室化，证明HER2/曲妥珠单抗复合物的内体内化。考虑到这些先例，作者旨在通过共聚焦显微镜研究活细胞中Ab-PROTAC 3的运输，以确认内化并进一步分析结合物在细胞内环境中的情况。对于这些研究，使用了荧光标记的AlexaFluor488-Ab-PROTAC（AF488-3），将HER2 + SK-BR-3细胞与100 nM AF488-3孵育1小时后洗涤细胞，并在1、4、8和24小时的时间成像以研究复合物的运输（见图3A）。1 h时在细胞表面观察到AF488-3，而在孵育4 h后AF488-3已经部分进入到不同的细胞室内，大概是初级和次级内体（图3A和3C）。8小时后AF488标记的区室与溶酶体广泛共定位（图3A和3C）；在没有将结合物洗脱的情况下也观察到了相似的结果。溶酶体消化Ab-PROTAC 3后须释放游离的活性PROTAC 1，然后进入细胞核以才能触发BRD4降解。在相同条件下表达**水平的HER2受体的MCF-7细胞无法摄取AF488-3（图3B），这与这些细胞的BED4不能被Ab-PROTAC诱导降解一致。

温馨提示：西安齐岳生物科技有限公司供应的产品仅用于科研，不能用于其他用途