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酶标记/荧光素标记/同位素标记和生物素标记单克隆抗体技术
发布时间:2021-04-14     作者:wyf   分享到:

酶标记/荧光素标记/同位素标记和生物素标记单克隆抗体技术

碱性磷酸酶(AP)标记

碱性磷酸酶(AP)用于标记抗体,常用戊二醛一步法,将酶和单抗混合,再加入适量戊二醛,使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合,制备成结合物。该法简便,但所得产物不均一,抗体活性损失大,酶标记率低。其程序如下:

1)将5mg AP加入1ml抗体溶液(2mg/ml)中溶解,装入透析袋,于4℃0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小时,换液三次。

2)加入2.5%戊二醛20ul,室温作用1-2小时,4℃PBS透析过夜,其间换液三次。

3)换用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液透析,4℃过夜,换液三次。

4)取出标记抗体,用含1%BSATris-HCl缓冲液稀释至4ml,即为AP标记物原液。

5)每毫升中加入0.4ml甘油,小量分装,保存备用。

 

PAPAPAAP的制备

PAP(过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术)、APAAP(碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术)的制备对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔PAPAPAAP试剂供应,只要配以相应的桥抗体,即可非常便利地应用单抗。因为PAP 法和APAAP法不用任何化学交联剂处理酶和抗体,它们的活性均不受化学因素的影响,提高了敏感性和特异性。PAPAPAAP试剂的制备方法常采用先将 HRPAP加入抗HRPAP的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物,再加入酶盐水,过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应,调PH2.3,随后立即中和,除去不溶解的沉淀物后,加入半饱和硫酸铵,纯化PAPAPAAP

根据需要还可将PAPAPAAP试剂先与相应桥抗体结合后,再与特定单抗组成完整的诊断试剂,这样,单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。

 

荧光素标记

1、异硫氰酸荧光素(FITC)标记

FITC标记抗体的原理是在碱性条件下,FITC 的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合,形成IgG与荧光素的结合物。FITC常用的荧光素,其次选用TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明)。FITCTRITC是常用的双标记组合。其标记步骤如下:

1)以碳酸盐缓冲液(PH9.3Na2CO3 8.6gNaHCO3 17.3g,蒸馏水1000ml)调整抗体浓度至10mg/ml

2)取5ml抗体溶液置于10ml小烧杯中。

3)称取1mg FITC溶于0.2ml DMSO中,待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内,边加边轻搅;其后室温避光作用2小时。

4)将交联物经Sephadex G25G50柱层析除去游离的荧光素;分管收集峰为标记的抗体。

5FITC的结合物质量鉴定

IgG量(mg/ml=OD280-OD495×0.35/1.4

F/P=2.87×OD495/OD280-OD495×0.35),一般说,FITC对抗体的摩尔比为31时适合于组织切片染色,为 5-61时适合于细胞悬液染色。以标记抗体染色各种抗原,测定其特异性染色滴度和非特异染色的程度。

6)标记抗体的保存:宜保存于4℃,加NaN3防腐。

 

2、异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记: 基本与FITC标记相同。

 

同位素标记

 

必须强调的是在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前,应掌握同位素操作和防护知识。正常情况下应包括避免物理的接触和对γ-射线照射的**保护,操作和使用同位素标记抗体时,应利用防护装置,并合理处置含放射性的废料。

 

1、碘标记

用碘标记抗体是一种**的标记方法。125I衰变产生低能的γΧ射线,很容易被检测出来,而其60天的半衰期保证足够的**使用期,且能很方便地处理放射废料。常用的碘标记方法是氯胺T法,即将氧化剂氯胺T加入到抗体和碘化物的溶液中,Na125I在氯胺T作用下I转化成I2,游离I2可与抗体分子中酪氨酸和一些组氨酸发生卤化反应,用还原剂和游离酪氨酸终止反应,经凝胶过滤将标记的抗体与碘化酪氨酸及还原剂分离开。其主要操作步骤如下:

1)在进行标记之前,先选用截流分子量为20000-50000的凝胶,制备1ml凝胶柱,然后分别用10倍体积的1%BSA/PBS /0.02%叠氮钠和PBS洗涤柱体,封住柱下口,备用。

2)加入10ug纯化单抗至含有25ul 2.5mol/L磷酸钠(PH7.5)的1.5ml指形管内。随后,加入500uCi Na125I混匀。

3)加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。室温放置60秒。再加入50ul氯胺T终止液(含2.4mg/ml偏重亚硫酸钠,10mg/ml酪氨酸,10%甘油和0.1%环乙烷酰二甲苯的PBS)。

4)将上述碘标记物上样在凝胶柱表面,小心放开柱体下口,用1.5ml指形管收集。当碘标记物全部进入柱体,加入0.3ml0.03%叠氮钠的 PBS,用另一指形管收集0.3ml,然后再加0.3ml 0.03% NaN3 PBS,下口收集0.3ml,重复进行,同时用同位素检测仪测定标记与未标记的单抗。标记抗体大约在**至第四管出现。无害化处理柱子和非单抗标记部分。

5)将标记单抗保存于4℃可使用6周时间。

 

生物合成法标记

将杂交瘤细胞培养在含有放射性前体的培养基中,随着抗体分子的合成、组装,同位素会标记在抗体分子的初级氨基酸链上,本方法不会导致抗体活性的丧失。其主要步骤是:

1)离心收集处于对数生长期的杂交瘤细胞,约需2×106个细胞。以预热37℃不含甲硫氨酸的培养基洗涤上述细胞。

2)用含2% PBS不含甲硫氨酸的培养基悬浮杂交瘤细胞至106/ml,加入35S甲硫氨酸(每次加入100uCi可产生105-106cpm的抗体)。

3)经C02培养箱中培养过夜,离心后,吸出培养上清,分别加入1/20体积的1mol/L TrisPH8.0)及叠氮钠至浓度0.02%。该标记抗体可按纯化单抗方法进行。

 

生物素标记

生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。其主要步骤是:

1、用二甲基亚砜配制10mg/mlN-羟琥珀酰亚胺生物素(应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯)。

2、用硼酸钠缓冲液(0.1mol/LPH8.0)稀释单抗溶液至1-3mg/ml

3、每毫克抗体加入25-250ug的生物素酯,混匀后,室温作用4小时。

4、按每250ug生物素酯加入20ul 1mol/L NH4Cl终止反应,室温放置10分钟。

5、以PBS充分透析除去游离生物素,标记抗体冻存。

 

其他标记技术   

适用于蛋白质的其他标记方法也可用于单抗,如金标记、化学发光标记、SPA标记、铁蛋白标记等

wyf 04.14

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