红细胞膜囊泡负载黑磷量子点(BPQD-EMNVs)的实验研究介绍-UDP糖丨MOF丨金属有机框架丨聚集诱导发光丨荧光标记推荐西安齐岳生物

黑磷是一种新型非金属层状半导体二维材料，具有从紫外到近红外的宽吸收光谱。研究人员已对不同厚度和大小的黑磷进行了生物成像和光热**研究，红细胞膜作为一种良好的纳米**载体，具有延长体内循环时间、安全无毒和生物相容性好等特点，得到了研究人员的广泛关注。本研究采用红细胞膜作为载体，将 BPQD 载入其中，制备负载黑磷量子点 BPQD 的红细胞膜纳米囊泡（BPQD-loadederythrocyte membrane nanovesicles，BPQD-EMNVs），并对其理化性质和抗**作用进行研究，以期为**症**提供一种新的策略。

一、黑磷量子点(BPQD)的制备:

取 20 mg 黑磷晶体，加入 5 ml NMP 于研钵中研磨至液体颜色发黑浑浊，然后将其转入圆底离心管中定容至 40 ml。将离心管置于冰浴中，采用细胞超声破碎仪进行超声，功率为 500 W，超声振幅为 30%，超声 5 s，间歇 5 s，连续超声 8 h。接着进行水浴超声，功率为 300 W，超声振幅为 80%，超声 8 h。超声后将样品 6 000× g 离心 30 min，缓慢吸取上清，继续27 000× g 离心 1.5 h，缓慢吸弃上清，取沉淀，保存于 NMP 中防止降解。

二、红细胞膜的提取:

ICR 雌性小鼠于动物室内分笼饲养，室内温度为（21±2） ℃，相对湿度为 30%~70%，光照 12 h，自由饮食进水。选取 6~8 周龄 ICR 雌性小鼠 10 只，眼球摘除取血，装入经肝素钠预先淋洗过的 EP 管中；4 ℃、1 200× g 离心 10 min，小心去除白细胞血清层；加入预冷磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），清洗红细胞 2 次；加入与红细胞等体积的预冷 PBS，4 ℃、1 200× g离心 10 min，小心去除PBS；配制 20 ml 预冷的 0.25×PBS（低渗液），将其与红细胞按体积比 2∶1 混合，反复吹打数次置于冰上，冰浴2 h，期间每 0.5 小时吹打几次；4 ℃、7 800× g 离心10 min，去除血红蛋白，EP 管底部粉红色沉淀即为红细胞膜，置于-20 ℃冰箱保存。

三、红细胞膜囊泡负载黑磷量子点(BPQD-EMNVs)的制备

将含有 BPQD 的 NMP 液体以 27 000× g 离心1.5 h，去除 NMP；然后加入适量质量浓度为 9 g/L 的NaCl 溶液重悬、吹打分散均匀；加入适量红细胞膜溶液，水浴超声 5 min（300 W、4 000 Hz、**功率），即可获得 BPQD-EMNVs。

如图 1 所示，制备的 BPQD鄄EMNVs 在透射电子显微镜下呈规则的球形结构，粒径约 200 nm（图 1A），而用纳米粒度及 Zeta 电位仪测得 BPQD-EMNVs 的

平均粒径为 228 nm（图 1B），两者结果基本一致。

如图 2 所示，随着 BPQD 质量浓度的增加，BPQD 的包封率逐渐增加；当 BPQD 质量浓度增至 100 mg/L时，包封率几乎不再增加，因此 BPQD鄄EMNVs的 BPQD 包封率约为 47%。

四、细胞摄取实验

将红细胞膜和 BPQD 分别用 cy5.5 和异硫氰酸荧光素进行荧光标记，然后按 1.2.3节方法制备BPQD鄄EMNVs。将小鼠****细胞 4T1 以 1×10 5 个/孔接种于 12 孔板中，加入荧光标记的 BPQD鄄EMNVs，于 37 ℃培养箱中孵育 2 h；去除培养基， PBS 洗3 次，用质量浓度为 40 g/L 的多聚甲醛溶液固定10 min；再用 4'，6鄄二脒基鄄2鄄苯基吲哚对细胞核进行染色，置于激光扫描共聚焦显微镜下观察拍照。

采用激光扫描共聚焦显微镜观察小鼠****细胞 4T1 对 BPQD鄄EMNVs 的摄取情况，结果如图 3所示，蓝色荧光为细胞核，在细胞核周围有许多紫色荧光，即被**细胞摄取的 EMNVs，绿色荧光为 EMNVs 内的 BPQD，该结果表明BPQD 可通过EMNVs 被**细胞摄取。

五、红细胞膜囊泡负载黑磷量子点(BPQD-EMNVs)在**部位富集

如图 4 所示，通过尾静脉注射荧光标记的BPQD-EMNVs 后，4T1 荷瘤 Balb/c 小鼠**部位的荧光强度随着时间的增加而增强，在 4 h 时荧光强度大，随后荧光强度渐渐变弱，表明在注射 4 h后，BPQD鄄EMNVs 在**部位的富集程度高。

六、动物体内**实验

4T1 荷瘤 Balb/c 小鼠分别注射 PBS、EMNVs、BPQD 和 BPQD-EMNVs 4 h 后，用 808 nm 近红外光对小鼠的**部位进行照射。图 5 为热成像仪记录的**部位温度随照射时间的变化曲线，可以看出照射 10 min 后，PBS 和 EMNVs 组小鼠**部位的温度无明显变化，上升了 2~3 ℃，而 BPQD 组小鼠**部位的温度可升至 43 ℃左右，这可能是由于部分BPQD 聚集至**部位所致。温度上升大的为BPQD-EMNVs 组，小鼠**部位的温度可达 53 ℃左右，该温度已满足杀死**细胞的条件，这也表明 BPQD 可通过 EMNVs 到达**部位并在**部

位**富集；与 BPQD 组相比，以 EMNVs 作为载体可大大提高 BPQD 在**部位的富集程度。