DMG-PEG2000-DBCO 与 Azide 分子的 SPAAC 偶联实验
以下是 DMG-PEG2000-DBCO 与叠氮（Azide）分子进行铜离子非依赖性 Click 反应（SPAAC） 的具体实验步骤，适用于构建靶向脂质体、功能化纳米颗粒、表面修饰等场景。
实验名称
DMG-PEG2000-DBCO 与 Azide 分子的 SPAAC 偶联实验
一、实验目的
利用 应变促使的环加成反应（SPAAC），将 DMG-PEG2000-DBCO 与带有叠氮基团（–N₃）的功能分子进行快速、温和、无金属共价偶联。
二、材料与试剂
材料名称 | 规格 | 说明 |
DMG-PEG2000-DBCO | 粉末或溶液（1–5 mg/mL） | 疏水锚定基 + PEG + DBCO 官能团 |
Azide-修饰分子（如 Azide-荧光染料、Azide-抗体） | 纯度≥95% | 应溶于水或DMSO中 |
PBS 缓冲液 | pH 7.4，1× | 反应介质 |
DMSO（若需） | 分析纯 | 用于溶解不溶于水的 Azide 分子 |
超滤管（10 kDa）或透析袋 | — | 去除未反应组分 |
避光反应容器 | — | 避免 DBCO 光降解 |
三、实验步骤
① 配制溶液
将 DMG-PEG2000-DBCO 溶于 PBS，浓度为 1–2 mg/mL（可轻微加热 37°C 加速溶解）。
将 Azide-分子 溶于 PBS 或 PBS+DMSO（若疏水），浓度根据需要设置为 0.5–2 mM。
按摩尔比 1:1.2–1:2（DBCO : N₃）混合反应液。
② 反应条件
条件 | 参数 |
温度 | 室温（20–25°C）或 37°C |
反应时间 | 30 分钟 – 2 小时（多数体系 30–60 分钟即完成） |
避光 | 建议全程避光以保护 DBCO 基团活性 |
总反应体系体积 | 200 μL – 1 mL（依据目标设定） |
③ 纯化步骤
使用 超滤离心管（MWCO 10 kDa） 或 透析袋（MWCO 3.5–10 kDa） 去除游离的 Azide 分子；
若构建脂质体，则可进一步通过凝胶色谱 (GPC)、离心清洗等方式进行纯化；
pH 最终调为中性，可直接用于生物实验或后续修饰。
四、结果表征（可选）
方法 | 说明 |
UV-Vis 或荧光光谱 | 若Azide分子为荧光探针，可验证结合 |
FTIR 或 NMR | 检测三唑环形成（仅用于研究） |
DLS/粒径分析 | 脂质体或纳米颗粒结合前后粒径变化 |
Zeta 电位 | 判断修饰程度 |
五、脂质体构建应用（如用于膜锚定）
如需构建功能脂质体，推荐如下方案：
配制脂质膜（如 DSPC:Cholesterol:DMG-PEG2000-DBCO = 55:40:5）
薄膜水化法或微射流法制备脂质体；
加入 Azide 分子进行 SPAAC；
反应后纯化，即得表面功能化脂质体。
六、注意事项
项目 | 建议 |
光敏性 | DBCO 对光较敏感，请避光操作与保存 |
温度控制 | 避免高温（>45°C）导致 PEG 脱落或脂质降解 |
反应速度 | SPAAC 反应极快，尤其在稀溶液中，建议立即纯化 |
金属离子 | 无需铜或其他金属催化，安全用于体内/细胞实验 |
七、常见 Azide 修饰分子示例
名称 | 应用 |
Azide-Cy5/Cy7 荧光探针 | 成像与追踪 |
Azide-PEG-FITC | 荧光标记与亲水修饰 |
Azide-抗体/适配体 | 靶向功能构建 |
Azide-Biotin | 链霉亲和素系统耦合 |
Azide-药物分子（如DOX） | 靶向递送药物系统构建 |
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