2-(2,4-二氯苯基)-3-氨甲基-4-取代-6-取代喹啉衍生物的合成及应用

摘要：本文以联苯化合物A7为先导化合物设计并合成了10个未见文献报道的2-(2,4-二氯苯基)-3-氨甲基-4-取代-6-取代喹啉衍生物(B1～B10)，并测定其对DPP-4的**率和IC50值。目标化合物通过引入的氮原子和芳香环可增强与酶Arg125和Tyr547残基的作用。其中，B2～B5(IC50=0.080～0.331μmol/L)和B7～B10(IC50=0.104～0.509μmol/L)显示出较好的体外**活性，与阳性对照药西格列汀(IC50=0.035μmol/L)相当。

具有DPP-4**活性的新型氨甲基联苯衍生物[4]，其中，代表化合物A7(图2)表现出较好的活性和一定的选择性：对DPP-4、DPP-7和DPP-8的**活性(IC50值)分别为0.082、2.750和0.560μmol/L。化合物A7与DPP-4酶的结合模式显示(图3，绿色)，2,4-二氯苯基与母环成垂直构象占据S1口袋，与其中的酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和缬氨酸(Val)的氨基酸残基发生疏水作用；氨基可与谷氨酸(Glu)205/206和Tyr662形成盐桥或氢键作用；三唑环伸向S2口袋与苯丙氨酸(Phe)357发生π-π叠加作用。

根据DPP-4酶腔体特点，S1和S2口袋之间有一个体积较大的空腔，可容纳多环母核结构(图3)。为进一步增强DPP-4的**活性，本文对化合物A7进行如下结构改造：①保留2,4-二氯苯基和氨甲基；②在苯环上引入N原子以增强其与精氨酸(Arg)125的作用，同时骈合一个苯环形成喹啉环，增强其与Tyr547的π-π叠加作用；③母环上引入给电子基团(甲氧基或甲基)，电子云密度增加有利于π-π叠加作用；④S2口袋结合基团为芳香环，并通过杂原子与喹啉母环相连。

化合物A7以及本研究设计的喹啉衍生物和DPP-4酶结合模式显示A7母环与喹啉母环几乎平行，2,4-二氯苯基、氨基与酶的结合模式基本一致，并且喹啉环较化合物A7拥有更多位置可进行结构修饰，易于引入与DPP-4酶其他氨基酸残基结合的官能团。

根据上述设计思想，本研究设计合成10个未见报道的B类喹啉衍生物(B1～B10)，这些新化合物的结构特征如下：①喹啉2-位为2,4-二氯苯基；②3-位为氨甲基；③4-位为S2口袋结合基团——芳香环或芳杂环，并通过杂原子(N、O或S原子)与喹啉母环相连；④6-位为给电基团甲氧基或甲基。B类化合物结构通式如图4所示。为验证所设计化合物的合理性，合成B11～B133个已知喹啉化合物[5]，与化合物B1～B10进行比较。

B类化合物是一种多取代喹啉化合物，其合成的关键是喹啉3-位氨甲基和4-位R2基团的引入。本研究以2,4-二氯苯甲酰氯(12)为起始原料，设计以下合成路线(图5)。化合物12与丙二酸二乙酯发生缩合反应得2-(2,4-二氯苯甲酰基)丙二酸二乙酯(13)[6—7]，经三氯氧磷氯化得2-[氯(2,4-二氯苯基)亚甲基]丙二酸二乙酯(14)，与苯胺化合物经取代反应得中间体15a和15b[8]。然后经高温环合制得2-(2,4-二氯苯基)-4-羟基-6-取代喹啉-3-羧酸乙酯(16a和16b)，再经氯代亚砜氯代得关键中间体2-(2,4-二氯苯基)-4-氯-6-取代喹啉-3-羧酸乙酯(17a和17b)，然后与亲核试剂(1,2,4-三唑、苯硫酚、4-氟苯硫酚、3-甲氧基苯硫酚或苯酚)发生亲核取代反应得2-(2,4-二氯苯基)-4-取代-6-取代喹啉-3-羧酸乙酯(18a～18j)，再经酯基还原得2-(2,4-二氯苯基)-3-羟甲基-4-取代-6-取代喹啉(19a～19j)。19a～19j

可与邻苯二甲酰亚胺发生Mitsunobu反应得2-(2,4-二氯苯基)-3-邻苯二甲酰亚胺甲基-4-取代-6-取代喹啉(20a～20j)；也可先与三溴化磷发生溴代

反应，再与邻苯二甲酰亚胺发生Gabriel反应得缩合产物20a～20j[9—10]。较后20a～20j经氨解制得目标化合物2-(2,4-二氯苯基)-3-氨甲基-4-取代-6-取代喹啉(B1～B10)，B11～B13的合成方法与B1～B10相似。

本研究对目标化合物的体外DPP-4**活性和选择性进行了初步研究。DPP-4酶活测定是利用甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺(Gly-Pro-p-nitroanilide)为底物的发色法，以此评价化合物的活性[11—12]。

本研究采用DPP-4DrugDiscoveryKit试剂盒(EnzoLifeSciences公司)对化合物B1～B13进行体外活性筛选。将B1～B13用DMSO溶解，配制

成浓度为10μg/ml的待测液。B1～B10(10μg/ml)初筛**率测定结果均大于50％，而化合物B11～B13(10μg/ml)的**率均小于50％，进一步证明目标化合物与酶结合模式的正确性。

再测定初筛**率测定结果大于50％的化合物(B1～B10)的IC50值。其中阴性对照、阳性对照西格列汀和被测样品均含DPP-4酶(17.3U/L)15μl，阳性对照、阳性空白对照、被测样品和被测样品空白对照均加入目标化合物待测液10μl，再用50mmol/L的Tris-HCl缓冲液将DPP-4酶和被测样品稀释至50μl，然后于37℃保温10min。测其在405nm处的吸收值，然后加入0.2mmol/L的甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺50μl反应1h，每隔5min测一次OD值。B1～B10每个样品测6个点(浓度依次为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和4.0μg/ml)，每个点取3个平行，较终结果取其平均值，并用软件(ICp)处理并计算其IC50值(表1)。

结果显示，除化合物B1和B6，其余化合物均表现出较好的DPP-4**活性，与阳性对照西格列汀(IC50=0.035μmol/L)相当。

由于S2口袋为疏水口袋，选取疏水性较强的苯巯基化合物B2和B3进行DPP-4及其同工酶DPP-7和DPP-8酶选择性的初步探究，实验方法同上。结果显示B2和B3的选择性不及A7和阳性对照药西格列汀(表2)。

根据上述活性测试结果可得出以下初步构效关系：

(1)化合物B1～B10(10μg/ml)**率均大于50％，其中化合物B5对DPP-4的IC50与A7相当，提示引入喹啉环，可保持**活性；

(2)喹啉4-位苯氧基取代活性优于苯巯基(如：B5优于B2、B3和B4；B10优于B7、B8和B9)，可能是由于氧原子半径小于硫原子，苯氧基较苯巯基更适合伸入S2口袋；

(3)1,2,4-三唑与喹啉母环直接相连，DPP-4**活性明显降低(如B1和B6)，提示分子刚性增强，三唑基不能进入S2口袋；

(4)甲氧基给电能力优于甲基，喹啉6-位为甲氧基取代时，喹啉环的电子云密度升高，有利于增强喹啉母环与Tyr547残基形成的π-π叠加作用(如B1～B5分别优于B6～B10)。

上述实验结果显示，化合物B2～B5和B7～B10均表现出较好的DPP-4**活性，与阳性对照药西格列汀相当，但同工酶选择性初步探究显示，该类化合物对DPP-7和DPP-8酶的选择性不及阳性对照药。下阶段将通过进一步结构修饰提高化合物的选择性以进行深入研究。

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wyf 05.27