在开发了表征多组分Fab-CKP-NLP偶联物的方案和分析工具后，我们接下来研究了控制CKP和Fab负载密度的能力，并评估了这些参数对Fab-CKPNLP大小、活性和血清稳定性的影响。

CKP-NLP与10 mol%的DOPE-PEG-Mal以两种CKP负载密度组装，12.7 CKP/NLP（称为低CKP-NLP）和40 CKP/NLP（称为高CKP-NLPs），并以不同的Fab与CKP-NLP比率与Fab结合。

显示了低CKP-NLP与Fab结合的SEC色谱图，Fab与CKP-NLPs的比例范围为0至150。值得注意的是，在*高Fab:NLP比为150时，对应于约1 Fab:1 DSPE-PEG-Mal。CKP-NLP峰随着Fab浓度的增加而逐渐增加，达到约150的饱和水平。随着Fab结合率的增加，观察到Fab二聚体和未结合的Fab峰逐渐增加。对于高CKP-NLP重复了这一过程，并按照材料和方法中的描述对Fab共轭量进行了定量。

对于这两种CKP组合物，当反应中Fab:NLP的比例从0增加到100时，观察到共轭Fab负载量（实际附着在NLP上的量）呈线性增加。然而，在较高比率下，观察到Fab负载量几乎没有增加，与NLP表面结合的Fab的饱和量被确定为约50Fab/NLP。

先前报道，当以10mol%的DOPE MCC脂质组合物通过DOPE-MCC脂质直接偶联到NLP表面时，Fab负载能力为30。这种装载能力被认为是由可用的NLP表面积驱动的，NLP表区域与30 Fab所占的总表面积之间存在很强的相关性。CKP-NLP的表面积与之前的出版物相似，因此Fab负载的增加不能归因于表面积的增加。

此外，我们观察到在没有CKP的情况下，Fab结合能力也有类似的增加，这表明这种效应不是由于NLP表面存在CKP造成的。在这项研究中，Fabs没有直接与表面结合，而是与从NLP表面延伸的PEG2000接头结合。

因此，与直接共轭到NLP表面相比，间隔物增加了整体共轭体积和有限的空间位阻，允许更多的Fabs与NLP共轭，这是合理的。有趣的是，CKP密度对Fab负载没有明显影响。考虑到在较高的CKP负载下可能存在更大的空间位阻，这有点出乎意料。PEG接头也消除了CKP的任何空间影响，这是合理的，因为这在NLP表面和Fab负载的偶联手柄之间创建了一个间隔物。

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