AF568-TSA,即 Alexa Fluor 568 Tyramide,是一种以Alexa Fluor 568荧光染料为核心的酪胺(tyramide)衍生物,属于信号放大技术(Tyramide Signal Amplification, TSA)体系的重要试剂之一。它结合了高亮度荧光染料和高反应活性的酪胺结构,广泛用于免疫检测、原位杂交(ISH)、免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学(ICC)以及多重荧光染色等生物学研究与诊断领域。
从分子结构上来看,AF568-Tyramide 是由 Alexa Fluor 568 荧光团通过碳链或短连接臂与酪胺(tyramine 或类似结构)偶联而成。Alexa Fluor 568 是一种基于罗丹明(rhodamine)类结构的荧光染料,发射波长在 603 nm 左右,激发波长约为 578 nm,呈现明亮的橙红色荧光,具有高的量子产率与光稳定性。相比传统罗丹明、Texas Red 等染料,Alexa Fluor 568 对光漂白的耐受性显著提高,尤其适用于荧光成像、共聚焦显微镜等需要长时间曝光或高功率激发的实验条件。
AF568-TSA 的核心技术依赖于 Tyramide信号放大机制(TSA)。在此系统中,首先利用辣根过氧化物酶(HRP, horseradish peroxidase)与靶标(如抗体或探针)的结合,将HRP定位于目标区域。随后加入含有 AF568-Tyramide 和微量过氧化氢的工作液,HRP 会催化过氧化氢分解产生高活性的酪胺自由基。这些自由基易与周围蛋白质中的酪氨酸残基发生共价结合,从而使 Alexa Fluor 568 分子牢固地“沉积”在靶标附近,大大增强荧光信号。这种放大效果能将检测灵敏度提升至常规免疫检测的10倍甚至上百倍,尤其适用于低丰度靶标的检测。
与其他荧光染料相比,Alexa Fluor 568 具有多项优异特性:
高亮度与高量子产率:发射光强强烈,即使在微弱信号下也易于检测。
光稳定性:在高强度光照下不易漂白,适合长时间观察。
pH稳定性:荧光在较宽的 pH 范围内保持稳定。
良好的水溶性:减少非特异性结合与背景噪音。
与常见激光线兼容:可被 561 nm 或 568 nm 激光有效激发,适用于多色荧光实验。
在实际应用中,AF568-TSA 主要用于以下场合:
免疫组织化学(IHC):用于组织切片染色,检测特定蛋白或抗原。
原位杂交(ISH):检测组织或细胞中的 RNA、DNA 序列,尤其是在病毒检测、癌症标志物分析中有广泛应用。
免疫细胞化学(ICC):用于细胞培养物中靶标分子的定位与定量。
多重染色实验:由于其发射波长与其他染料(如 AF488, AF647)区分度高,可用于多重标记分析。
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