文献：使用分子定义的成像剂对*性*PD-L1*体定位进行多尺度成像

链接：https://link.springer.com/article/10.1186/s12951-022-01272-5

作者：艾里斯·M·哈格曼斯，彼得·J·维尔斯特拉卡斯·施图滕Janneke DM 莫尔肯波尔-库南，杜科·范·达伦马丁·特尔·比斯特约翰·MS ·范德舒特奥尔加·伊琳娜马丁·戈特哈特卡尔·G·菲格多尔费伦茨·A·舍伦，桑德拉·赫斯坎普马丁·维尔多斯

节选：

位点特异性酶促结合

优化后，使用0.5-1.0 mg*体（片段）和25 eq IH18或IH20对mIgG1 PD-L1进行批量分选，使用50 eq IH18或IH20对Fab PD-L1进行批量分选。用EDTA（终浓度为10 mM）终止反应后，将反应混合物与200 µl Ni-NTA珠在室温下孵育20分钟，以除去未反应的*体和分选酶。使用空的旋转柱（Jena Bioscience，AC-552-25）将珠子从反应混合物中分离，并用洗涤缓冲液（50 mM NaH 2 PO 4 .H 2 O，300 mM NaCl，20 mM 咪唑，0.05％Tween 20，pH 8.0）洗涤两次，用PBS洗涤两次。将反应混合物和洗涤级分合并，并使用尺寸排阻色谱法（SEC）纯化，以 PBS 中的 1 mM EDTA 作为缓冲液（10 mL/min）。将含有产物的级分合并，并使用 Amicon Ultra-15 离心过滤装置、MWCO 10 kDa（Merck，Z717185）浓缩。使用无菌 PBS 进行缓冲液交换。在 NanoDrop 上测定*体浓度，使用 UV-vis 程序，在 280 nm 处测量IH20，在 280 和 646 nm 处测量IH18。在还原条件下使用 SDS-PAGE 凝胶电泳（12% 丙烯酰胺）评估蛋白质纯度，比较原料、产物和用 5 kDa mPEG-DBCO 点击的产物，以验证所有重链的功能化。每个构建体生产几个批次，并在进行体外和体内实验之前将这些批次合并，以确保批次均匀性。使用密度测定法定量蛋白质纯度。在ImageJ中进行密度测定，定义为（产物条带-背景）/（非产物条带-背景）×100%。纯度mIgG1 PD-L1-IH18 = 85%，Fab PD-L1-IH18 = 96%。

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