文献：Ratiometric fluorescence imaging of cell surface pH by poly(ethylene glycol)-phospholipid conjugated with fluorescein isothiocyanate

作者：Ryuichi Ohgaki, Yuji Teramura, Daichi Hayashi, Lili Quan, Suguru Okuda, Shushi Nagamori, Madoka Takai & Yoshikatsu Kanai

文献链接：https://www.nature.com/articles/s41598-017-17459-y

首先研究了即使在与PEG脂质结合后，FITC是否仍保持其pH依赖性荧光特性。将FITC-PEG脂质悬浮在一系列不同pH值（pH 2.0-10.0）的缓冲溶液中。然后，在519的检测波长下，用荧光分光光度计记录激发光谱（400-510nm） nm。

FITC-PEG脂质的荧光在495处显示主峰 nm和465处的肩峰 并且显示出明显的pH依赖性。使用氩激光线（458 nm和488 nm）验证我们的比率共焦激光扫描显微镜 nm），检测路径为500-550 nm，在相同的设置下记录发射光谱。

在两种激发波长下，FITC-PEG脂质的荧光强度在碱性中性pH值下较高，在酸性pH值下较低。中绘制了获得的积分荧光比（500-550 nm）与pH值的关系图，说明了与PEG脂质结合的FITC的pH指示特性。该图符合双相双位点竞争配体结合曲线。

结果表明，两个不同的质子化位点主要影响FITC-PEG脂质的荧光比。拐点在pH 2.79和6.17，接近之前报道的阳离子中性形式FITC的pKa值（pKa = 2.19) 和单阴离子二阴离子形式（pKa = 6.33),分别为22。

荧光比在pH 2.0-7.5范围内具有独特的值。然而，由于酸性pH值下的荧光强度较低，pH 4.5左右的动态响应较小，因此确定FITC-PEG脂质的最佳检测范围在弱碱性和酸性pH值之间。当pH 6.0的缓冲溶液中省略Na+和/或K+时，荧光比仅受到可忽略的影响，这表明探针对质子的选择性高于这些生理上单价阳离子。

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