产品名称：FITC-Transferrin，异硫氰酸酯荧光素-转铁蛋白的合成方法与优化

合成方法与优化

1. 反应体系设计

溶剂选择：

常用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）或碳酸盐缓冲液（pH 9.0），后者可提高氨基的亲核性，促进反应效率。

摩尔比控制：

FITC与Tf的摩尔比通常为10:1至20:1，以确保充分标记同时避免过度修饰导致蛋白活性丧失。

反应条件：

温度：4°C（低温减少蛋白降解）或室温（25°C，加速反应）。

时间：1-2小时（需通过时间梯度实验优化）。

避光：FITC对光敏感，反应需在暗处进行。

2. 具体操作步骤

Tf预处理：

将Tf溶解于缓冲液（如PBS，pH 7.4），浓度调整至1-5 mg/mL。

通过超滤或透析去除可能存在的杂质（如二价离子）。

FITC溶解：

将FITC溶解于无水DMSO（终浓度≈10 mg/mL），避免水解。

偶联反应：

在搅拌下缓慢滴加FITC溶液至Tf溶液中（摩尔比FITC:Tf=15:1）。

4°C避光反应2小时，或室温反应1小时。

纯化分离：

凝胶过滤层析：

使用Sephadex G-25或PD-10脱盐柱，以PBS为洗脱液，分离FITC-Tf与未反应的FITC。

超滤离心：

通过10 kDa截留分子量的超滤管（如Amicon Ultra-15），离心浓缩并更换缓冲液。

表征验证：

荧光光谱：

测定激发/发射波长是否与FITC一致（λ_ex=495 nm, λ_em=520 nm）。

SDS-PAGE：

通过凝胶电泳分析蛋白纯度及标记后分子量变化（FITC-Tf应比未标记Tf略大）。

BCA蛋白定量：

测定FITC-Tf浓度，结合荧光强度计算标记效率（FITC分子数/Tf分子）。

受体结合实验：

通过流式细胞术或ELISA验证FITC-Tf与TfR的结合能力（需与未标记Tf对比）。

温馨提示：仅用于科研，不能用于人体实验！wyh

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