喹啉类化合物二肽基肽酶-4(DPP-4)的**作用

摘要：本文以联苯化合物A7 为先导化合物设计并合成了10 个未见文献报道的2-(2,4- 二氯苯基) -3- 氨甲基-4- 取代-6- 取代喹啉衍生物(B1 - B10)，并测定其对DPP-4 的**率和IC50 值。目标化合物通过引入的氮原子和芳香环可增强与酶Arg 125 和Tyr 547 残基的作用。

具有DPP-4 **活性的新型氨甲基联苯衍生物[4]，其中，代表化合物A7( 图2) 表现出较好的活性和一定的选择性：对DPP-4、DPP-7 和DPP-8 的**活性( IC50值) 分别为0.082、2.750 和0.560 μmol/L。化合物A7 与DPP-4 酶的结合模式显示( 图3，绿色)，2,4- 二氯苯基与母环成垂直构象占据S1 口袋，与其中的酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp) 和缬氨酸(Val)的氨基酸残基发生疏水作用；氨基可与谷氨酸(Glu)205/206 和Tyr 662 形成盐桥或氢键作用；三唑环伸向S2 口袋与苯丙氨酸(Phe)357 发生π-π 叠加作用。

根据DPP-4 酶腔体特点，S1 和S2 口袋之间有一个体积较大的空腔，可容纳多环母核结构( 图3)。为进一步增强DPP-4 的**活性，本文对化合物A7 进行如下结构改造：①保留2,4- 二氯苯基和氨甲基；②在苯环上引入N 原子以增强其与精氨酸(Arg)125 的作用，同时骈合一个苯环形成喹啉环，增强其与Tyr 547 的π-π 叠加作用；③母环上引入给电子基团( 甲氧基或甲基)，电子云密度增加有利于π-π 叠加作用；④ S2 口袋结合基团为芳香环，并通过杂原子与喹啉母环相连。

化合物A7 以及本研究设计的喹啉衍生物和DPP-4 酶结合模式显示A7 母环与喹啉母环几乎平行，2,4- 二氯苯基、氨基与酶的结合模式基本一致，并且喹啉环较化合物A7 拥有更多位置可进行结构修饰，易于引入与DPP-4 酶其他氨基酸残基结合的官能团。

根据上述设计思想，本研究设计合成10 个未见报道的B 类喹啉衍生物(B1 ～ B10)，这些新化合物的结构特征如下：①喹啉2- 位为2,4- 二氯苯基；② 3- 位为氨甲基；③ 4- 位为S2 口袋结合基团——芳香环或芳杂环，并通过杂原子(N、O 或S 原子)与喹啉母环相连；④ 6- 位为给电基团甲氧基或甲基。B 类化合物结构通式如图4 所示。为验证所设计化合物的合理性，合成B11 ～ B13 3 个已知喹啉化合物[5]，与化合物B1 ～ B10 进行比较。

B 类化合物是一种多取代喹啉化合物，其合成的关键是喹啉3- 位氨甲基和4- 位R2 基团的引入。本研究以2,4- 二氯苯甲酰氯(12) 为起始原料，设计以下合成路线( 图5)。化合物12 与丙二酸二乙酯发生缩合反应得2-(2,4- 二氯苯甲酰基) 丙二酸二乙酯(13) [6—7]，经三氯氧磷氯化得2-[ 氯(2,4-二氯苯基) 亚甲基] 丙二酸二乙酯(14)，与苯胺化合物经取代反应得中间体15a 和15b[8]。然后经高温环合制得2-(2,4- 二氯苯基)-4- 羟基-6- 取代喹啉-3- 羧酸乙酯(16a 和16b)，再经氯代亚砜氯代得关键中间体2-(2,4- 二氯苯基) -4- 氯-6- 取代喹啉-3- 羧酸乙酯(17a 和17b)，然后与亲核试剂(1,2,4- 三唑、苯硫酚、4- 氟苯硫酚、3- 甲氧基苯硫酚或苯酚) 发生亲核取代反应得2-(2,4- 二氯苯基) -4- 取代-6- 取代喹啉-3- 羧酸乙酯(18a ～18j)，再经酯基还原得2-(2,4- 二氯苯基) -3- 羟甲基-4- 取代-6- 取代喹啉(19a ～ 19j)。19a ～ 19j

可与邻苯二甲酰亚胺发生Mitsunobu 反应得2-(2,4-二氯苯基) -3- 邻苯二甲酰亚胺甲基-4- 取代-6- 取代喹啉(20a ～ 20j) ；也可先与三溴化磷发生溴代

反应，再与邻苯二甲酰亚胺发生Gabriel 反应得缩合产物20a ～ 20j[9—10]。较后20a ～ 20j 经氨解制得目标化合物2-(2,4- 二氯苯基) -3- 氨甲基-4- 取代-6- 取代喹啉(B1 ～ B10)，B11 ～ B13 的合成方法与B1 ～ B10 相似。

本研究对目标化合物的体外DPP-4 **活性和选择性进行了初步研究。DPP-4 酶活测定是利用甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺(Gly-Pro-p-nitroanilide) 为底物的发色法，以此评价化合物的活性[11—12]。

本研究采用DPP-4 Drug Discovery Kit 试剂盒(Enzo Life Sciences 公司) 对化合物B1 ～ B13 进行体外活性筛选。将B1 ～ B13 用DMSO 溶解，配制

成浓度为10 μg/ml 的待测液。B1 ～ B10(10 μg/ml)初筛**率测定结果均大于50 ％， 而化合物B11 ～ B13(10 μg/ml) 的**率均小于50％，进一步证明目标化合物与酶结合模式的正确性。

再测定初筛**率测定结果大于50％的化合物(B1 ～ B10) 的IC50 值。其中阴性对照、阳性对照西格列汀和被测样品均含DPP-4 酶(17.3 U/L)15 μl，阳性对照、阳性空白对照、被测样品和被测样品空白对照均加入目标化合物待测液10 μl，再用50 mmol/L 的Tris-HCl 缓冲液将DPP-4 酶和被测样品稀释至50 μl，然后于37 ℃保温10 min。测其在405 nm 处的吸收值，然后加入0.2 mmol/L 的甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺50 μl 反应1 h，每隔5 min 测一次OD 值。B1 ～ B10 每个样品测6 个点( 浓度依次为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 和4.0 μg/ml)，每个点取3 个平行，较终结果取其平均值，并用软件(ICp) 处理并计算其IC50 值( 表1)。

结果显示，除化合物B1 和B6，其余化合物均表现出较好的DPP-4 **活性，与阳性对照西格列汀(IC50=0.035 μmol/L) 相当。

由于S2 口袋为疏水口袋，选取疏水性较强的苯巯基化合物B2 和B3 进行DPP-4 及其同工酶DPP-7 和DPP-8 酶选择性的初步探究，实验方法同上。结果显示B2 和B3 的选择性不及A7 和阳性对照药西格列汀( 表2)。

根据上述活性测试结果可得出以下初步构效关系：

(1) 化合物B1 ～ B10(10 μg/ml) **率均大于50％，其中化合物B5 对DPP-4 的IC50 与A7 相当，提示引入喹啉环，可保持**活性；

(2) 喹啉4- 位苯氧基取代活性优于苯巯基( 如：B5 优于B2、B3 和B4 ；B10 优于B7、B8 和B9)，可能是由于氧原子半径小于硫原子，苯氧基较苯巯基更适合伸入S2 口袋；

(3)1,2,4- 三唑与喹啉母环直接相连，DPP-4 **活性明显降低( 如B1 和B6)，提示分子刚性增强，三唑基不能进入S2 口袋；

(4) 甲氧基给电能力优于甲基，喹啉6- 位为甲氧基取代时，喹啉环的电子云密度升高，有利于增强喹啉母环与Tyr 547 残基形成的π-π 叠加作用( 如B1 ～ B5 分别优于B6 ～ B10)。

上述实验结果显示，化合物B2 ～ B5 和B7 ～B10 均表现出较好的DPP-4 **活性，与阳性对照药西格列汀相当，但同工酶选择性初步探究显示，该类化合物对DPP-7 和DPP-8 酶的选择性不及阳性对照药。下阶段将通过进一步结构修饰提高化合物的选择性以进行深入研究。

喹啉化合物产品列表：

喹啉类

5-氨基喹啉580-15-4

5-甲基喹啉491-35-0

异喹啉119-65-3

喹啉-d7

8-氨基喹啉578-66-5

4-喹啉醇611-36-9

6-甲基喹啉91-62-3

4-喹啉甲醛4363-93-3

5-氨基喹啉611-34-7

8-甲基喹啉611-32-5

5-喹啉醇578-67-6

8-喹啉硼酸86-58-8

2,4-喹啉二醇86-95-3

2,8-喹啉二醇15450-76-7

8-羟基喹啉148-24-3

6-羟基喹啉580-16-5

喹啉黄8003-22-3

3-氨基喹啉580-17-6

2-羟基喹啉59-31-4

2,2′-联喹啉119-91-5

喹啉黄8004-92-0

2-氨基喹啉580-22-3

2-溴喹啉2005-43-8

2-苯基喹啉612-96-4

3-溴喹啉5332-24-1

3-甲基喹啉612-58-8

3-喹啉甲醛13669-42-6

4-溴喹啉3964-04-3

5-硝基喹啉607-34-1

6-氯喹啉612-57-7

6-硝基喹啉613-50-3

6-溴喹啉5332-25-2

8-硝基喹啉607-35-2

8-溴喹啉16567-18-3

2-喹啉甲醛5470-96-2

喹啉-3-羧酸6480-68-8

喹啉-4-羧酸486-74-8

5-溴喹啉4964-71-0

8-喹啉甲酸86-59-9

2-氯喹啉612-62-4

4-氯喹啉611-35-8

7-甲基喹啉612-60-2

喹唑啉253-82-7

3-喹啉硼酸191162-39-7

1,2,3,4-四氢喹啉635-46-1

全氢异喹啉6329-61-9

喹喔啉N-氧化物6935-29-1

3-羟基异喹啉7651-81-2

上述产品齐岳生物均可供应，仅用于科研！

小编：wyf 07.06