一、Ni柱亲和层析
1、自制的简易柱子,直径约为1cm,长度约为2cm,在柱子的下端加入蒸馏水,并关闭柱子的出口。
2、将琼脂糖凝胶倒入柱子,让填料自然沉降,依次用二到五倍的柱子体积的无菌水、8mol/L的尿素、无菌水洗柱子。
3、缓慢加入5ml的硫酸镍,至柱子的颜色由白色变为蓝色,待蓝绿色收集液体滴下来为止。
4、用二到五倍体积的PBS缓冲液平衡柱子,再将粗蛋白样品进行上样,用梯度浓度50mmol/L、70mmol/L、150mmol/L、250mmol/L咪唑进行过柱,流速约为1ml/min。
5、以每个浓度用1.5ml的Eppendorf收集八管,再用二到五倍体积的无菌水洗柱子,再用二到五倍的50mmol/L的EDTA洗柱子,除去NiSO4,待至无色状态
6、用多倍体积的无菌水进行洗柱子,将手机液10%的分离胶进行SDS—PAGE分析。
二、离子交换层析
1、将macro prep High-Q强阴离子交换填料混匀,吸取16 ml于小烧杯中,静置待填料沉降至烧杯底部,吸取并弃去上清。
2、在烧杯中加入4倍体积的ddH2O,混匀,静置,沉降后去上清。重复2次以充分洗去保存填料中的乙醇。
3、在空柱中加入柱体积10%的装柱缓冲液,静置除去可能存在于柱壁和柱底部薄膜上的气泡。
4、以1:1(v/v)比例在烧杯中加入装柱缓冲液(20 mM sodium phosphate, pH 7.0, 1 M NaCl),混匀。用玻璃棒引流加入至柱中,并用装柱缓冲液填满剩余柱体积。静置30 min。
5、待填料均沉降至柱底部后,将适配器以较小的倾斜角度插入至柱中填料顶部。
(1)打开柱低端开口,以较大流速10 ml/min泵入装柱缓冲液,压实填料。
(2)缓慢降低缓冲液的流速,并将装柱缓冲液更换成结合缓冲液(20 mM sodium phosphate, pH 7.0)。
(3)设定蛋白纯化程序,使用15倍柱体积缓冲液线性梯度洗脱目的蛋白。
(4)收集流出液,进行SDS-PAGE检测。
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