单克隆抗体的基本概念、原理、制备工艺和应用

　　1.单克隆抗体的基本概念。

　　单个B细胞克隆产生的高度均匀，仅针对特定抗原位置的抗体称为单克隆抗体。杂交瘤(hybridoma)抗体技术通常在细胞融合技术的基础上，将具有特异性抗体分泌能力的致敏性B细胞和具有增殖能力的骨髓瘤细胞融入B细胞杂交瘤。通过将具有这一特征的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可以为抗原位置制备特异性抗体，即单克隆抗体。

　　2.单克隆抗体技术的基本原理。

　　为了制备单克隆抗体，**需要获得可合成抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。实验发现，骨髓瘤细胞可以在体外生长和增殖。骨髓瘤细胞与免疫淋巴细胞相结合，通过细胞杂交技术获得杂种骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承了两种代际细胞的特征。它不仅具有B淋巴细胞合成抗体的特征，而且具有体外骨髓瘤细胞的培养和增殖的特征。单克隆抗体可由单个融合细胞的细胞组制备。其制备原理如下：

　　3.单克隆抗体制备的基本工艺。

　　(1)免疫动物。

　　免疫动物是利用抗原免疫小鼠产生致敏性B淋巴细胞的过程。一般来说，根据预先制定的免疫计划，选择6-8周龄的雌性Balb/C小鼠进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应的B淋巴细胞克隆、激活、增殖和分化为致敏性B淋巴细胞。

　　(2)细胞融合。

　　用眼球切除放血法杀死小鼠，无菌手术去除脾脏，挤压平容器，制备脾细胞悬浮液。将准备好的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并添加聚乙二醇。在聚乙二醇的作用下，淋巴细胞可以融合成杂交瘤细胞。

　　(3)选择性培训。

　　选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，通常使用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，由于缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，未融合的骨髓瘤细胞无法通过补救方法合成DNA而死亡。虽然未融合的淋巴细胞包括黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但它们不能在体外长期存活并逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞才能在HAT培养基中生存和增殖，因为它们从脾细胞中获得次黄嘌呤类嘌呤磷酸核糖转移酶，具有骨髓瘤细胞的特点。

　　(4)杂交瘤阳性克隆筛查克隆。

　　只有少数生长在HAT培养基中的杂交瘤细胞是分泌预定单克隆抗体的细胞。因此，必须进行筛查和克隆。杂交瘤细胞的克隆培养通常采用有限稀释法。阳性杂交瘤细胞可以通过免疫学筛选出能够产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。确定单克隆抗体分泌的免疫球蛋白类型、亚类、特异性和亲和力后，应及时冷冻。

　　(5)制备单克隆抗体。

　　大量单克隆抗体主要采用动物内诱生法和体外培养法：

　　①体内诱导法采用Balb/c小鼠，先在腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，杂交瘤细胞在腹腔接种。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，产生和分泌单克隆抗体。大约1-2周后，你可以看到小鼠腹部扩张。用注射器提取腹水，获得单克隆抗体。

　　②体外培养方法将杂交瘤细胞放入培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集和培养上清液，离心去除细胞及其碎片，获得所需的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，新的培养技术和装置不断出现，增加了抗体的产量。杂交瘤细胞应在使用前进行筛选。杂交瘤细胞有两种：一种是筛选杂交瘤细胞;另一种是筛选杂交瘤细胞，它们可以在初选杂交瘤细胞中产生特异性抗体。这两种筛选方法和原理不同。

　　4.单克隆抗体制备的应用。

　　生命科学实验具有医学价值，可用于制备单克隆抗体：

　　(1)凝集实验:haemaglutination。

　　(2)沉淀反应:Precipitationreaction。

　　(3)ELISA等免疫学检测。

　　(4)亲和分析:分离蛋白质。

　　(5)免疫印记(westernbloting)

　　(6)免疫沉淀。

　　(7)BIAcorebiosensor:检测Ab-Ag或与蛋白质的亲和力。

　　(8)通过放射免疫学检测免疫复合物。

　　(9)磁珠分离细胞。

　　(10)流式细胞仪:用于细胞分型和细胞分离。

　　(11)临床疾病的诊断和**。