分离纯化-单克隆抗体的七个步骤(含抗体标记定制产品)

　　一般的单克隆抗体的纯化工艺中主要是采用色谱分离技术的，这个技术也就是常说的层析分离法(Chromatography)。通过层析分离后的收获液，再加上辅料，就变成了常说的原液了。一般的说，层析分离主要是指亲和层析(AC)、阳离子交换层析(CEX)和阴离子交换层析(AEX)。

　　分离纯化步骤

　　一、亲和层析:免疫吸附,捕获目的蛋白

　　分离纯化中主要的几个步骤是层析分离，分离纯化其实就是载量比较大的液相色谱是个用于生物制品的制备液相。通常的，会把亲和层析叫做粗纯，将阳离子交换层析和阴离子交换层析叫做精纯，下面我们先看看亲和层析。亲和层析的原理，就是依靠填料对单克隆抗体的特异性吸附，捕获单抗。大概就是下面图里(图1)这个原理：

　　二、低pH值孵育:杀灭病原体

　　这是个排在亲和层析之后，阳离子交换层析之前的步骤。主要的目的是要去除病毒和其他一些病原体。

　　三、阳离子交换层析:离子交换，纯化目的蛋白

　　低pH值孵育处理后，就要开始阳离子交换了。亲和层析获得的洗脱液，只是初步纯化的产物，阳离子交换后，很多杂蛋白就被去掉了，尤其是亲和层析时从填料上脱落一些Protein A蛋白，在这一步也能被很好的去除。阳离子交换的原理，简单地说就是用带正电的单抗替换掉填料上的阳离子，其他的杂蛋白和杂质都随穿透液流走了，再用更强离子强度的离子从填料上替换掉单抗，收获液中就可以得到更纯的单抗了。基本上就是下图这个原理(图2)：

　　四、阴离子交换层析:离子交换，去除杂质

　　经过阳离子交换，杂蛋白基本去除了，剩下的一些DNA、内毒素和其他杂质，可以用阴离子交换的方式去掉。阴离子交换的原理也是同种电荷替换，与阳离子交换原理接近(如图)

　　五、纳滤:过滤去除病毒

　　阴离子交换后，就要进行纳滤除病毒，大概原理就是(下图)这个原理，基本可以理解为是个孔径很小的，小到可以滤掉病毒的过滤：

　　六、超滤浓缩和洗滤置换

　　1.超滤浓缩:浓缩蛋白至特定浓度

　　2.洗滤置换:置换蛋白缓冲液至特定缓冲体系

　　纳滤后的液体需要再经过UF/DF处理，这里面要分成两个步骤：一是UF，也就是超滤浓缩，因为经过阴离子交换和纳滤之后，收获液被大大的稀释了，目的蛋白的浓度已经不适合用于制剂灌装了，需要通过超滤的方式进行浓缩，达到适合灌装的浓度;二是DF，也就是洗滤置换，也就是要把含有蛋白的缓冲液体系，从经过一系列纯化和过滤后，已经变的乱七八糟的组分换成可以配制成原液的组分。

　　无论是UF还是DF，基本原理都是切向流，大概的原理见下图

　　七、原液配制:加入辅料，形成原液

　　经过以上一些列操作，杂质和病原体被去除了，蛋白质浓度也适宜了，缓冲体系也符合要求了，再加上辅料，就可以成为能用于灌装的原液了。

　　总而言之，分离纯化的目的就是把经过细胞培养而得到的，组分复杂的发酵收获液，经过一系列层析分离、过滤、超滤、洗滤、添加辅料等处理，使之成为能够用于制剂生产的原液。

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