Fitc-溶壁酶|FITC-Lyticase

检测 FITC - 溶壁酶的活性可以采用以下几种方法：

1.比浊法：

原理：利用溶壁酶分解细菌细胞壁使悬液中细菌细胞破碎，导致悬液浊度降低，通过测量浊度的变化来反映酶的活性。

操作步骤：

制备底物：使用研钵和研杵将面包酵母研磨成粉末（细度在 25-30 目之间），用超纯水制备成 4mg/ml 的酵母悬液。搅拌约 1 小时后，静置 30 分钟，取上部三分之二的上清液作为底物。测量底物在 800nm 处的吸光度，吸光度差值（）应在 0.7-1.0 之间，如有必要，可调整酵母粉或超纯水的用量来达到该吸光度范围。

设置反应体系：在比色皿中加入适量的磷酸盐缓冲液（67mM 磷酸钾缓冲液，pH7.5，25°C）和一定量的 FITC - 溶壁酶溶液，然后加入调整好的酵母底物悬液，使总体积为 3ml。

测量吸光度变化：使用分光光度计在 800nm 处，每隔一定时间（如每分钟）测量反应混合物的吸光度值。单位定义为：在 pH7.5、25°C 下，在 3ml 反应混合物中每分钟使吸光度降低 0.001 的酶量为一个单位的溶壁酶活性。

2.荧光法：

原理：FITC 本身具有荧光特性，在一定条件下，FITC - 溶壁酶与底物反应后，体系的荧光强度会发生变化，通过检测荧光强度的变化来测定酶的活性。

操作步骤：

制备标准曲线：使用已知活性的 FITC - 溶壁酶标准品，在特定的反应条件下（如一定的温度、pH 值和反应时间），与不同浓度的底物反应。反应结束后，使用荧光分光光度计测 量体系的荧光强度，以酶活性为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。

样品测定：将待测的 FITC - 溶壁酶样品在与标准品相同的反应条件下与底物反应，反应结束后测量荧光强度，根据标准曲线计算出酶的活性。

3.平板法：

原理：将 FITC - 溶壁酶作用于含有细菌的平板培养基，溶壁酶分解细菌细胞壁使细菌细胞破裂，形成透明的溶菌圈，通过测量溶菌圈的大小来判断酶的活性。

操作步骤：

制备含菌平板：将适量的细菌接种到固体培养基上，培养至形成均匀的菌苔。

打孔：在含菌平板上用打孔器打出若干个小孔。

加样：在小孔中加入一定量的 FITC - 溶壁酶溶液，同时设置空白对照（加入等量的缓冲液）。

培养与观察：将平板放置在适宜的温度下培养一段时间，观察小孔周围是否出现透明的溶菌圈。测量溶菌圈的直径或面积，根据溶菌圈的大小来判断 FITC - 溶壁酶的活性。

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