电化学酶联免疫分析法是将酶免疫分析法同电化学分析结合的一种分析方法,既有免疫分析的高特异性,又有电分析化学的高灵敏度。近年来,电化学酶联免疫分析法得到了越来越多的重视"，常用的方法有流动注射分析安培法[2~$、线性扫描伏安法[6~8等。以伏安法检测酶反应的产物,是一种比较快速简便的方法。

辣根过氧化物酶(HRP)是常用的标记酶之一,对HRP测定的关键是选择合适的底物体系,以达到较好的灵敏度和检出限。常用底物的稳定性较差，见光或空气极易被氧化,使得底物的保存及体系的灵敏度受到了限制。近年来,文献{报道了以铬黑T为HRP的底物光度法检测HO，文献报道了以酸性铬蓝K为HRP的电化学底物,用于HRP的测定。本文发现HRP可促进HO2氧化甲基红的反应,且在一定条件下,甲基红可产生良好的伏安峰,据此建立了测定HRP的酶联伏安分析方法,用于HRP和IgGHRP、Avidin-HRP的测定。

1实验部分

1.1仪器与试剂

DS-2005伏安极谱仪，采用三电极系统,静汞电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极,铂电极为对电极;PHS-3C精密pH计。

辣根过氧化物酶(HRP,> 250 U mg，上海雪满生物科技有限公司):准确称取0.0100 g HRP,溶解并定容至10 mL，得质量浓度为1.0×10-3g mL4℃冰箱保存,使用时逐级稀释;Hz02:4.0×10 3mol h，用时现配;1.00 mg mL甲基红:准确称量甲基红0.0500 g,用乙醇溶解并定容至50 mL,使用时再稀释至工作浓度;0. 04 molL Briton-Rob-inson (B一R)缓冲溶液: pH值为4.35。

1.2实验方法

于5 mL比色管中，依次加入0.20 mL 0. 10mg mL甲基红,1.50 mL B一R缓冲溶液,2.0 mL 4.0×10 3 molL HO2溶液，一定量的HRP，二次水定容到5 mL，室温下放置10 min后，以Eo=-0.2 V为起始电位，静止时间为5 s,扫描速率为0.3 V /s进行阴极化扫描,记录线性扫描二阶导数伏安图(图1)，记录峰电流(Ip)，同时做空白(lo)，以△I=(Io一Ip)值进行定量。

2 结果与讨论

2.1酶催化反应条件

HRP的反应活性与缓冲溶液的pH值有密切

的联系,考察了溶液pH值对嗨催化反应的影响，当pH值在4.10~4.56之间对酶催化反应更有利,所以选择pH 4.35的B一R缓冲溶液作为介质,且发现在5 mL试管中加入1.5 mL pH 4.35 B一R缓冲溶液后,可以得到更大且稳定的极谱峰电流;同时考察了缓冲溶液的浓度和甲基红的浓度对反应的影响,其更好用量分别为2.0 mL 4.0×103molLHO2,0.20 mL 0.10 mg mL甲基红。反应时间的影响试验表明，在室温下反应10 min,测量信号稳定﹑精密度好且△I更大。

2.2伏安曲线特性

由图1可见HRP能催化氧化还原反应的发生,使甲基红被氧化分解,其平衡浓度降低,对应的还原峰电流降低。考察了在pH 为4.35的B一R缓冲介质中的伏安行为，静止时间的影啊买验衣明,在3~9 s的静止时间内,随着时间的延长,峰电流有所增加,实验选择静止时间为5 s;随着起始电位的负移,峰电流值减小,实验选择起始电位为—0.2 V;当扫描速率在0.05~0.30 Vl变化时,当扫描速率为0.3 V s时,峰电流大,因此实验选择0.3 Vk进行扫描。循环伏安曲线表明(如图2)，在—0.51 V处有一还原峰,而无对应的氧化峰,说明电极过程是不可逆的。且进行多次循环扫描时,峰电流逐渐减小,可见该伏安峰受吸附控制。综上所述,此伏安过程是受吸附控制的不可逆过程。

2.3 HRP及其标记物的测定

在选定的实验条件下，加入不同量的HRP,绘制HRP质量浓度和峰电流的关系曲线,结果如图3所示,HRP在5.0×10-8~5.0× 10 7g hmL之间与△Ⅰ呈线性关系，其线性回归方程为:△Ip(A)=1545.3p(× 107g mL)＋ 107.6，相关系数r=0. 9971。对2.0×107 g hmL HRP进行11次测定的相对标准偏差为4.6%,方法的检出限为1.8×10 8g mL。

应用本体系对羊抗兔(IlgG-HRP)标记物进行测定,线性范围为3.3×10-8~4.9×10'g mL(如图4所示)。其线性回归方程为:-Ip('A)=352.7P(1.64×10°g mL)—91.82,相关系数r=0.9953。

同样本体系应用于Avidin-HRP的测定，Avidin-HRP的稀释比在16250~1*50000之间与△Ⅰ呈线性关系(如图5),更大稀释比为1*50000,相关系数r=0.996。

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