辣根过氧化物酶是一种糖蛋白,由于其稳定性好、分子量小、比活性高、特异性强和易于分离提纯等特点，广泛用于酶免疫分析中作为标记物．测定HRP的活性可以间接确定体液或其它组织液中待测抗原或抗体的量．因此，HRP的测定对免疫学和组织化学的研究以及临床疾病的诊断具有很重要的意义.

HRP的测定目前常用催化光度法,其灵敏度较低，作为底物的邻苯二胺又具有潜在的致**作用．近年来，基于HRP催化Luminol-HgO。化学发光反应的化学发光酶免疫分析(CELISA)灵敏度很高"，但在通常使用的固相吸附法中，是在固相表面测量化学发光，重现性较差．另外血清样品中某些蛋白质的非特异性吸附,导致背景信号的升高和信噪比的降低，使其测定灵敏度较之放射免疫分析仍有逊色.

本文提出一种HRP及其标记物的新的化学发光测定方法--一-偶合反应化学发光分析法，该法将HRP催化HgO氧化KI生成I的反应与工uminol-Ig的化学发光反应偶合起来，根据发光强度确定HRP及其标记物的量．此法测定HRP(RZ=2.5-3)的线性范围是10—6000 pg(或0.25-150 fmol),检测下限为7pg(或0.18 fmol)，对20 pg HRP进行11次乎行测定，相对标准偏差为7.5%、与HRP催化Luminol-HpO。法比较，测游离HRP的灵敏度提高3倍，测HRP标记物的灵敏度提高10—100倍，能与放射免疫分析相媲美，且克服了上述固相吸附法直接测定HRP的缺陷,提高了测定的选择性.

实验

仪器和试剂  LKB-1250发光光度计；ModelSA 720酸度计;微量取样器(50、100、200、500 uL);酶联免疫吸附板.Luminol溶液(5.0×10~3moL·dm~3):用0.1 moEdm-8NaHCOg-NaOH溶液容解配制;KI溶液: 2.0×10~3 moL-dm-3，HgO溶液:2.0×10-* moLdm3;HR溶液(1.0:10g-mL-1)、称取100 mg HRP(RZ=2.5—3),溶解后,用蒸馏水稀释至100 mL，4℃冰箱保存．使用时用蒸馏水逐级稀释;HRP的乙型肝炎抗原和抗体等的标记物:HBsAg-HRP、HBsAb-HRP、HBoAb-HRP、PHSAR-HRP。

操作步骤  于26 mL容量瓶中先加入约10mL水后，加入1.0mL EDTA溶液(1.0 g·mL-1),2.5 nL2,0×10~3 moLdm-3KI溶液，2.5 mL 2.0×10~moL·dm-3Hg0浴液,用水稀释至标线,摇匀备用.

用微量取样器吸取上述溶液200 pL于酶联免疫吸附板中，加入100 pL HRP(或其标记物),室温暗处放置20 min后,取此溶液100 puL放入LKB-1250发光光度计反应室，从仪器加液处加入500 uL5.0×10-3 moL·dm-3 Luminol，记录反应所产生的光信号强度，同时作空白试验后,绘制发光强度与HRP浓度间的关系曲线.

结果与讨论

偶合反应的时间特性 偶合反应的速度受酶促反应速度和化学发光反应速度两者影响,在碱性介质中，低浓度的碘氧化Luminol的化学发光反应属于快速的双电子氧化的一级反应2,其反应机理为

记录的化学发光动力学曲线(图1)显示出它属于一种延滞性的快速化学发光，达到发光峰值的时间为1.5s，所以控制偶合反应的主要因素是酶催化HgO氧化KI生成I。的反应，由图2可见,这一反应经历两个阶段,在反应开始阶段(图中曲线0A段)，底物分子和酶分子的催化活性中心未能充分接触，故此时生成Iz的速度较慢;随反应进行，所有酶的活性中心都参予了反应,生成I2的速度迅速增加(曲线AB段)，且与反应时间呈线性关系，因而可以控制一-定的反应时间(如20 min)进行测定.

偶合反应的条件

酶促反应的pH值﹐研究了HR催化Hg0z氧化KI生成I的反应中p互值的影响(图3)，发现在pH3.5—3.7范围内有较大的催化活性，而I2氧化Luminol的反应则以pH10为佳.

图1 Laminol-化学发光反应的动力学曲线

图2偶合反应的时间特性

图3 酶促反应pH值影响

Laminol溶液的浓度 Luminol溶液浓度以及所处介质对Luminol-I2的化学发光反应影响较大,研究结果表明,在0.1 mo L-dm-3 NaHCOg-NaOH介质中,选用5.0×10-8moL-dm-3 Luminol浓度,能获得更大的发光信号.

H2O2与 KI溶液的浓度 对H2O2与KI的适宜测定浓度进行了试验，发现当H2O2浓度为2.0×10-5 moL-dm-8、KI溶液浓度为2.0×10-4moL-dm-3时,有利于这一测定的进行.

蛋白质浓度的影响 为了模拟人血清的干扰，我们用牛血清白蛋白代替人血清考察了其加入量对化学发光信号的淬灭影响.结果表明,随反应混合物中蛋白质浓度增加,化学发光信号逐渐减弱,当其浓度大于0.2 mg.mL1时,化学发光强度接近零．这种蛋白质对化学发光信号的淬灭作用是均相免疫测定的重要障碍，但对酶联免疫固相吸附法无影响.

EDTA浓度 EDTA可以掩蔽试剂及水中痕量杂质对测定的影响,降低空白信号，因而在测定溶液中加入少量EDTA对测定灵敏度有利,但EDTA量大时对化学发光信号有淬灭作用，兼顾两者的影响，我们选用1.6—3.2×10~*g-mL-1 EDTA为合适浓度.

HRP浓度与发光强度的关系 在上述适宜条件下测定不同浓度HRP时的化学发光峰值信号，绘制工.作曲线(图4),在10-6000 pg(或0.25—-150 fmol)HRP范围内符合直线关系，检出限为7pg(或0.18 fmol)，对20 pg HRP进行11次平行测定，相对标准偏差为7.5%(表1).

直接催化反应与偶合反应化学发光测定HRP及其标记物的比较研究 HRP直接催化Luminol-HgOg的化学发光反应测定HRP的灵敏度还不够高（与偶合法比较）,这主要是受到反应条件的限制．HRP催化作用的pH值是中性或弱酸性条件,而Luminol化学发光反应在pH10左右量子产率高.因此,若在酶的适宜活性条件下测定,发光反应量子产率低,测定灵敏度不高;反之,若在发光反应条件下测定，由于HR在碱性条件下不稳定,催化活性中心易破坏而使催化能力丧失,亦得不到灵敏的测定结果.

本文提出的偶合反应成功地解决了这一难题．因为HgO:-KI的反应正是在HRP反应pH值条件下进行的，而产物I与Luminol的化学发光反应的p互条件恰好亦是Luminol量子产率高的条件，另外发光反应测定I的灵敏度本身就很高(检出限为10-9nol.dm—3),此法实际上又是两种催化反应的偶合,比它们中任何一个单独催化反应的灵敏度要高得多.

对于HRP标记物的测定,两类方法灵敏度的差别更为突出．和其它酶一样，HRP的活·性中心只是其分子的一部分,它存在于分子表面，当其与底物接触时起催化作用，考察这一催化反应的动力学可知,其催化反应的速度受两个因素控制:1．扩散速度为底物扩散至酶的活性中心表面,与酶的活性中心接触,反应后,产物再从酶表面扩散至溶液中;2．酶促反应速度为底物与酶的活性中心接触后,在酶的参与下进行反应的速度．当HRP处于游离态时,活性中心暴露在分子表面,底物分子很容易与其接触，因此催化反应速度仅取决于**个因素，符合Michaelis-Menten方程;但是,当HRP被标记到一个大分子蛋白质上后,由于空间位阻效应,使HRP的活性中心与底物的接触受到阻碍，由于扩散需要一定时间，而化学发光反应速度很快,底物加入的瞬间发光强度即达更大,因而仅有部分酶与底物接触,参与化学发光反应，故灵敏度不高.

偶合反应克服了上述动力学过程对测定的影响,它先使Hg0与KI底物与标记物经过一定时间的充分接触，再加入工uminol测定I的化学发光信号，因而使HRP标记物的测定灵敏度大大提高．表2列出采用偶合反应和直接催化反应化学发光法测定HRP及其标记物的结果.

研究表明,无论是测定游离HRP还是其标记物,利用偶合反应化学发光分析法测定的灵敏度均高于直接催化法,因而能很好地用于化学发光酶免疫分析中。

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