核酸提取磁珠分离与纯化的步骤（ 细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子 物质分离、核酸纯化等）

核酸分离与纯化的步骤

大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子 物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。

1. 细胞裂解:

核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。

(1) 机械作用:   包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子 量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ～ > 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。

(2) 化学作用:  在一定的p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍) 而获得。而p H 环境则由加入的强碱(NaOH) 或缓冲液 ( TE、STE 等) 提供。在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ,从而**核酸酶的活性,保护核酸不被降解。

(3) 酶作用: 主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶) 以使细胞破裂,核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 ℃及有EDTA 、尿素(1～4mol/ L) 和去污剂(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。

2. 酶处理:

在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解,以利于核酸的分离与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或链酶蛋白酶) 可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸。

3. 核酸的分离与纯化:

核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性,根据它们理化性质的差异,用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将核酸分离、纯化。

(1) 酚提取/ 沉淀法:

核酸分离的一个**方法是酚∶氯仿抽提法。细胞裂解后离心分离含核酸的水相,加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25 ∶24 ∶1 体积) 混合液。依据应用目的,两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸) 或简单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸) 后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相,核酸则被留于上层水相。酚是一种有机溶剂,预先要用STE 缓冲液饱和,因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联：故在制备酚饱和液时要加入82羟基喹咛,以防止酚氧化。

氯仿可去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。**的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀,在含核酸的水相中加入p H5. 0～5. 5 ,终浓度为0. 3M 的NaOAc 或KOAc 后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性环境中促进核酸的疏水复性。

然后加入2～2. 5 倍体积的乙醇,经一定时间的孵育,可使核酸**地沉淀。其他的一些有机溶剂[ 异丙醇、聚乙二醇( PEG) 等]和盐类(10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等) 也用于核酸的沉淀。不同的离子对一些酶有**作用或可影响核酸的沉淀和溶解, 在实际使用时应予以选择。经离心收集,核酸沉淀用70 %的乙醇漂洗以除去多余的盐分,即可获得纯化的核酸。

(2) 层析法:

层析法是利用不同物质某些理化性质的差异而建立的分离分析方法。包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等方法在内的层析法。因分离和纯化同步进行,并且有商品试剂盒供应,而被广泛应用于核酸的纯化。在一定的离子环境下,核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。另外一些选择性吸附方法以经修饰或包被的磁珠作为固相载体,磁珠可通过磁场分离而无需离心,结合至固相载体的核酸可用低盐缓冲液或水洗脱。该法分离纯化核酸,具有质量好、产量高、成本低、快速、简便、节省人力以及易于实现自动化等优点。

玻璃粉或玻璃珠被证实为一种**的核酸吸附剂。在高盐溶液中,核酸可被吸附至玻璃基质上,离液盐碘化钠或高氯酸钠可促进DNA 与玻璃基质的结合。Dederich 等用酸洗玻璃珠分离纯化核酸,获得高产量的质粒DNA。在该方法中,细胞在碱性环境下裂解,裂解液用醋酸钾缓冲液中和后,直接加至含异丙醇的玻璃珠滤板,被异丙醇沉淀的质粒DNA 结合至玻璃珠,用80 %乙醇真空抽洗除去细胞残片和蛋白质沉淀。较后用含RNase A 的TE 缓冲液洗脱与玻璃珠结合的DNA ,获得的DNA 可直接用于测序。

Elkin 等使用羧化磁珠分离纯化质粒DNA。该法在细胞裂解后,离心分离含质粒的水相,再加入羧化的磁粒,然后用 PEG/ NaCl 沉淀,使目的DNA 吸附至磁珠,较后磁场分离被吸附的DNA ,经乙醇洗涤,用水洗脱,可获得高产量的适用于毛细管测序的模板DNA。

也有用铁粒为固相支持物,经磁场分离而纯化质粒DNA 的报道。细菌用溶菌酶2煮沸法裂解,质粒被释放至悬浮液中, 加铁珠捕获,用磁场使铁珠分离,经漂洗后用水洗脱质粒,可获得高产量、测序级的质粒DNA。

亲和层析是利用待分离物质与它们的特异性配体间所具有的特异性亲和力来分离物质的一类层析方法。Chandler 等报道了一种用肽核酸(PNA) 分离核酸的方法。PNA 是一类以 N-(2-氨乙基)2甘氨酸结构单元为骨架的DNA 类似物,可作为纯化皮克(pg) 级核糖体DNA ( rDNA) 和核糖体RNA ( rRNA) 的试剂。在该方法中,以生物素标记的肽核酸(peptide nucleic acids ,PNAs) 为探针,以包被了抗生蛋白链菌素的磁珠作为固相载体。PNA 探针在高盐环境下, 与目的核酸(DNA 或 RNA) 混合,经煮沸、冰浴、温育杂交步骤后,直接加入包被了抗生蛋白链菌素的顺磁性颗粒,经静置捕获PNA-核酸杂交体,水洗而获得纯化的核酸。

Schluep 等亦基于亲和层析原理: 采用一种三螺旋体DNA 的方式进行质粒DNA 的分离。三螺旋体DNA 由同质嘌呤2 同质嘧啶双螺旋链与同质嘧啶单链组成,单链上的T 识别A ·T 碱基,对形成T ·A ·T 三联体,质子化的单链胞嘧啶 (C+ ) 识别G·C 碱基对形成C ·G·C 三联体。在适当的条件下,三螺旋体的结合具有高特异性和高稳定性。将配体聚嘧啶寡核苷酸链通过化学方法连接至Sephacryl S21000 SF 颗粒上形成亲和载体。当含目的序列的质粒DNA 溶液与其混合时,在酸性环境(p H 4. 5～5. 5) 下,质粒结合至亲和载体颗粒上,溶液中高浓度的NaCl 可稳定三联体形式并减少与蛋白质、细胞DNA 的非特异性结合。经一段时间反应后,颗粒悬浮液被加至一层析柱,用适当的洗脱液改变p H 值至碱性环境,可使三联体解聚,质粒被洗脱。经该法分离质粒DNA ,质粒产量可达到加入量的62 %。

也有用Schizophyllan ( SPG) 制备亲和层析柱分离纯化 RNA 的报道。SPG是一种β21 ,32葡聚糖,在低温下,含RNA 的流动相通过层析柱,Poly (C) 和poly (A) 与SPG通过氢键和疏水作用形成复合物而被吸附于柱上,然后通过改变缓冲液成分,将被吸附的RNA 洗脱。亲和层析应用于核酸分离与纯化的另一个例子是用oligo ( dT)2纤维素层析法从真核细胞总 RNA 中分离带poly (A) 尾的mRNA。

在该方法中,短链oligo (dT) 通过其52磷酸与纤维素的羟基共价结合而连接至纤维素介质上。当样本经过oligo (dT) 柱时,mRNA 因其poly (A) 可与短链oligo (dT) 形成稳定的RNA2DNA 杂合链,而被连接到纤维素介质上,从而与其他RNA 分离。在适当的条件下(低盐、加热) ,poly (A) RNA 可被水洗脱而得以纯化。

离子交换层析以具有离子交换性能的物质为固定相,其与流动相中的离子能进行可逆交换,从而能分离离子型化合物。用离子交换层析纯化核酸是因为核酸为高负电荷的线性多聚阴离子,在低离子强度缓冲液中,利用目的核酸与阴离子交换柱上功能基质间的静电反应,使带负电荷的核酸结合到带正电的基质上,杂质分子被洗脱。

然后提高缓冲液的离子强度,将核酸从基质上洗脱,经异丙醇或乙醇沉淀即可获得纯化的核酸。该法适用于大规模核酸的纯化。Ferreira 等用含0. 5 M NaCl 的TE 缓冲液平衡层析柱,加样后用含1 M NaCl 的TE 缓冲液洗脱核酸,获得了很好的分离效果。

(3) 密度梯度离心法: 密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。双链DNA、单链DNA、RNA 和蛋白质具有不同的密度,因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带, 该法适用于大量核酸样本的制备,其中氯化铯2溴化乙锭梯度平衡离心法被认为是纯化大量质粒DNA 的选方法。氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质,梯度液中的溴化乙锭与核酸结合,离心后形成的核酸区带经紫外灯照射,产生荧光而被检测,用注射针头穿刺回收后,通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。