酶与抗体交联的方法有许多种，根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备 HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠发。尤以简易过碘酸钠法更为常用。

戊二醛二步法

1、原理:戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶—戊二醛—免疫球蛋白结合物。

2、标记步骤

(1）称取HRP25mg溶于12.5mL/L戊二醛溶液中，于室温静置过夜。

(2)反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在1mL/min，收集棕的流出液。如体积大于5mL，则以PEG浓缩至5mL。放置25mL小烧杯中，缓慢搅拌。

(3）将待标记的抗体112.5mg用生理盐水稀释至5mL，搅拌下逐滴加入酶溶液中。

(4）用1M pH9.5碳酸盐缓冲液0.25mL，继续搅拌3~4小时。

(5）加0.2M 赖氨酸0.25mL，混匀后，置室温2小时。

(6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。

(7） 3000rpm/min离心 30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M、pH7.4的PBS中。

(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M、pH7.4的PB缓冲液透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10000rpm/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。

3、结果判定

(1）定性及效价测定:用特异性抗原(或抗体）同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散实验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA(或正式实验系统里)对酶结合物进行滴定（见(三）工作浓度的选择)。

(2）本法标记步骤比较简单，重复性好，缺点是酶的利用率低，一般只有2%~4%的酶与蛋白质结合。

4、试剂和器材

( 1)0.1M、pH6.8磷酸盐缓冲液(PBS):取0.2M Na2HPO4 49mL ,0.2M NaH2PO4 51mL,NaCl 1.8g，加蒸馏水至200mL。

(2) 12.5mL/L戊二醛液:取250mLL戊二醛50mL与 pH6.8的PBS确? mL混合。

(3)  1M、pH9.5碳酸盐缓冲液(PBS):取 1M Na2CO3 3mL与1M NaHCO3 7mL混合。

(4) 0.2M赖氨酸溶液:称赖氨酸29.2mg溶于0.01M、pH9.5碳酸盐缓冲液1mL中。

(5) 0.15M、pH7.4的PBS及生理盐水。

(6） pH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。

(7） 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG、MW2000)

(8）纯化的特异性抗体或抗lg抗体。

(9）HRP(RZ>3.0)。

(10）SephadexG-25层析柱（2cmX50cm)。

(11）搅拌器、分光光度计、离心机。

(12）透析袋、大小烧杯，试管，吸管等。

简易过碘酸钠法

本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与lg上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近70%的HRP和Ig 结合,99%的Ig 与酶集合,酶与Ig的活性无重大损失,是目前最常用的方法.

1、原理:**的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的a-和e氨基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低 pH下使NalO4氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏碱，后者可进一步用兵NaBH(或乙醇胺）还原生成稳定的酶标记抗体。

2、标记步骤

(1）称取5mgHRP溶解于1mL蒸馏水中。

(2）于上液中加入0.2mL新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。

(3）将上述溶液装入透析袋，对1mM, pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。

(4）加20pL 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化物的pH升高到9.0~9.5，然后立即加入10mglgG，室温避光轻轻搅拌2小时。

(5）加0.1mL新配的 4mg/mL NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。

(6）将上述溶液装入透析袋，对0.15M,pH7.4PBS 透析，4℃过夜。

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