提供一种 FITC标记蛋白的使用方法

1.制备溶于0.1M碳酸钠缓冲液( pH 9.0 )的待标记蛋白溶液,浓度≥2mg/ml.

2 )溶解FITC于无水DMSO配制成1mg/ml的溶液。

3 )对于1ml蛋白溶液加入50μFITC溶液,可按照每次5μ的量边加边轻轻搅拌蛋白溶液;

4 )待所需FITC加入完毕,将反应液于4°C避光孵育8h ;

5 )加入NH4CI使其终浓度至50mM , 4°C终止反应2h ;

6)加入二甲苯青至浓度0.1% ,甘油至浓度5% ;

7 )通过大小孔径合适的凝胶过滤层析分离排除未被结合的FITC ,分离范围在20,000至50,000 (球蛋白例如抗体)。待凝胶柱平衡后,将以上反应混合波从柱顶注入，

打开凝胶柱,待其全部流入柱床后,加入PBS缓冲液。

此时,可以形成两条带: a,快速移动带,也就是FITC-蛋白标记物,先被洗脱,通常于室内光下可看到; b,慢速移动带,也就是未结合蛋白的FITC和二=甲苯青。仅仅在PBS缓冲液清洗后被洗脱出来。

8 )于4°C避光储存上述偶联物,加入0.1% ( w/v )叠氮化钠作为-种防腐剂。若蛋白浓度较低( < 1mg/ml) , 可加入1%BSA作为-种蛋白稳定剂。

9)标记物中荧光素和蛋白的比值( F/P )可通过测定495nm和280nm处的吸光值来鉴定, F/P应位于0.3-1.0。小于该比例则信号太低，高于该比例则背景太高。

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小编zhn2021.03.22