乙型肝炎病毒（HBV）的一个特点是前C/C区编码的构成病毒核衣壳的core蛋白和前C蛋白（precore）存在高度的氨基酸序列同源性，后者经过加工、成熟为分泌型的HBeAg。该研究使用T细胞受体（TCR）转基因（Tg）、TCR×HBc / HBeAg双转基因和三联转基因实验组，证明在该系统中HBeAg引起T细胞耐受，而HBcAg不引起耐受。

 TCR×HBc 双转基因小鼠在幼年时就会发生血清转换，抗-HBc IgG抗体呈阳性；但TCR×HBc×HBe三联转基因小鼠血清中存在的HBeAg会阻止抗-HBc血清转换。HBeAg通过引起HBc/HBeAg特异性T细胞耐受而发挥免疫调节作用。结果表明，HBV之所以保留了核蛋白的分泌形式，是因为它起着T细胞耐受原的作用，调节对胞内核衣壳的免疫应答。这种由HBeAg介导的免疫调节可能会导致围生期感染的慢性化，并防止成人感染HBV后严重肝损伤的发生。

乙型肝炎病毒e抗原（precore或HBeAg）以单体的形式分泌到血清中，而核心抗原（core 蛋白或HBcAg）是包裹病毒DNA和聚合酶的核衣壳的构成成分，参与病毒颗粒组装。由于氨基酸同源性较高，这两种抗原形式在T细胞反应水平上具有交叉反应性，但在抗体识别水平上却不具有交叉反应性。自HBeAg被发现起，因为它并非病毒感染、复制或组装所必需，其功能广受猜测。该文作者曾基于小鼠实验提出HBeAg发挥免疫调节的作用，但相关问题仍有待厘清。Precore、core两种形式的核蛋白共存于HBV自然感染过程中，并对HBcAg和HBeAg的免疫应答似乎是独立调节的。例如，HBcAg可以表现为T细胞非依赖性抗原，而对HBeAg的免疫应答则是严格的T细胞依赖性的；HBcAg优先诱导Th1细胞，而HBeAg优先诱导Th0/Th2细胞。HBcAg和HBeAg主要的抗原提呈细胞也不同。

HBeAg的T细胞耐受性明显更高。T细胞对HBeAg的耐受是克隆性的，并且至少可以通过三种机制介导：克隆清除（clonal deletion）、克隆无能（clonal anergy）和克隆忽视（clonal ignorance）。血清HBeAg可能会清除亲和力高的T细胞，而中等亲和力的HBeAg特异性T细胞可能不会被清除，但仍可以通过克隆无能引发免疫耐受。因此，即使是亲和力较低的HBeAg特异性T细胞也容易出现HBeAg诱导的耐受。

既往研究以T细胞受体转基因（TCR Tg）小鼠谱系为代表，主要集中在单一的对HBc / HBeAg具有中等亲和力的特异性T细胞克隆群。而在该研究中，使用表达HBcAg和/或HBeAg的转基因小鼠繁育TCR-Tg小鼠，以产生7/16-5×HBc、7/16-5×HBe双转基因和7/16-5×HBc×HBe三联转基因实验组小鼠，用来检查内源性HBeAg和HBcAg在单独和联合时对特定的HBc/HBeAg特异性T细胞亚群的影响。结果表明，血清HBeAg可以作为**的T细胞耐受原，在HBcAg是强免疫原的转基因系统中下调对HBcAg的免疫应答。

一、血清HBeAg**自发的抗-HBc IgG抗体血清转换

作为慢性HBV感染的模型，TCR×HBc/HBeAg 转基因小鼠被用于探究持续的抗原暴露对T细胞的影响。7/16-5 Tg TCR (Vβ11⁺-Vα5⁺)对 HBc/HBeAgs的120–140残基特异，受I-Aᵇ MHC II类分子限制, 表达于53%的CD4⁺ T 细胞。在该研究中，六只表达HBc/HBeAg特异性7/16-5 TCR和HBcAg（7/16-5×HBc）的双转基因小鼠在4至6周龄时全部自发血清转换为抗-HBc IgG抗体阳性（图1），产生了所有IgG亚型的抗-HBc抗体；丰富程度从高到低依次为IgG2b、IgG2a、IgG1和IgG3。在7/16-5×HBc 双转基因小鼠中自发的抗-HBc血清转换表明，HBcAg没有耐受性，而是在体内充当7/16-5 T细胞的免疫原。由于颗粒状HBcAg在B细胞水平上具有很高的免疫原性，因此从肝细胞中“泄漏”出来的少量的这种胞内抗原足以引起自发的抗-HBc血清转换。

相比之下，在7/16-5×HBe双转基因小鼠中，不会引起自发的HBeAg向抗-HBe （IgG抗体）血清转换，表明7/16-5 T细胞可以耐受血清HBeAg。通过繁殖能够同时表达7/16-5 TCR、HBcAg和HBeAg的三联转基因小鼠，以确定在对HBcAg的免疫原性应答和对HBeAg的耐受性应答之间，谁会占据主导地位。在六只7/16-5×HBc×HBe 三联转基因小鼠中，血清中的HBeAg（4-10μg/mL）阻止了其中两只的自发抗-HBc IgG抗体血清转换，并在其余四只小鼠中****抗-HBc IgG抗体的产生（图1）。三联转基因小鼠产生的抗-HBc不但抗体低水平，并且抗体出现时间延迟、 IgG亚型有限。据此可见，血清HBeAg是作为一种免疫调节蛋白在体内下调对HBcAg的体液反应。

图1. 血清HBeAg**抗-HBc自发血清转换。每组6只7/16-5×HBc双（dbl）转基因小鼠和7/16-5×HBc×HBe三联（tri）转基因小鼠，3至28周龄之间取血，收集血清，并通过ELISA测定抗-HBc抗体的总IgG和IgG亚型。通过终点稀释血清定量检测抗-HBc抗体。符号代表单独的小鼠。7/16-5 Tg TCR（Vβ11⁺-Vα5⁺）对HBc / HBeAgs的120-140残基具有特异性，受IA ᵇ MHC II类分子限制，并在53％的CD4⁺ T细胞上表达。对照HBcAg单转基因小鼠未自发产生抗-HBc抗体。

分离7/16-5×HBc、7/16-5×HBe 双转基因和7/16-5×HBc×HBe三联转基因小鼠的脾细胞，在存在HBcAg或HBeAg的条件下进行体外培养。在脾脏原代培养中，7/16-5×HBc脾细胞产生大量抗-HBc IgG抗体，而7/16-5×HBe双转基因脾细胞未产生抗-HBe IgG抗体，且三联转基因脾细胞也未产生抗-HBe IgG抗体（图2 A）。体外脾脏原代培养物中IgG抗体的产生与体内抗-HBc/e IgG抗体的产生平行（图1）。体外7/16-5×HBe双转基因脾细胞未产生抗-HBe IgG抗体，证明在体内检测不到自发抗-HBe IgG抗体不是由于免疫复合物或血清HBeAg对抗-HBe的掩盖。

接着检测脾脏培养上清液中是否有抗-HBc IgM抗体的产生。如图2 B所示，所有7/16-5 TCR⁺ 双转基因和三联转基因小鼠的脾细胞在与HBcAg原代培养后均产生抗-HBc IgM抗体（7/16-5 TCR单转基因脾细胞在与HBcAg原代培养后也产生了抗-HBc IgM抗体），值得注意的是7/16-5×HBc×HBe三联转基因小鼠的脾细胞在体外不产生抗-HBc IgG抗体，而会产生高水平的抗-HBc IgM抗体。与7/16-5×HBc双转基因脾细胞相比，7/16-5×HBc×HBe三联转基因脾细胞中抗-HBc IgG抗体和抗-HBc IgM抗体的生成分别被**和增强。由此可以推断，在HBeAg存在时，在产生的抗体从抗-HBc IgM转变为IgG的过程中，Th的重要性降低了；并且，在HBeAg存在的同时又有Th功能不足时，HBcAg一般会诱导产生更多的抗-HBc IgM抗体。这一发现可能与在慢性HBV患者中经常观察到的抗-HBc IgM抗体的周期性复发有关。

图2. 7/16-5 TCR⁺ 双转基因和三联转基因小鼠脾细胞体外抗-HBc/e抗体的产生。向来自7/16-5×HBc和7/16-5×HBe双转基因小鼠以及7/16-5×HBc×HBe三联转基因小鼠的脾细胞加入不同浓度的重组HBcAg或HBeAg，培养5天。收集培养物上清液，并通过ELISA确定IgG（A）和IgM（B）抗-HBc / e抗体的产生。分析未稀释的培养物上清液，并将结果表示为OD₄₉₂ 值，减去从无抗原的培养基对照孔中获得的背景OD₄₉₂ 值进行校正。符号代表单独的小鼠，并且结果代表每组至少五只小鼠。

之前对HBeAg下调抗-HBc血清转换的简单解释是：由于氨基酸序列的高度同源性，血清HBeAg可能在检测中掩盖了抗-HBc抗体。然而，实际上将HBeAg-Tg小鼠的血清添加到抗-HBc抗体的稀释液中不会影响抗-HBc抗体的检测。对7/16-5×HBc×HBe三联转基因小鼠抗-HBc产生减少的**个可能解释是：表达两种转基因的小鼠肝脏中的HBcAg含量较低。尽管HBc/HBe双转基因小鼠细胞内HBcAg的表达往往比HBc单转基因小鼠约少一半，但抗-HBc血清转换与肝脏中HBcAg含量之间没有相关性，表明低浓度HBcAg浓度（0.2-2.0μg/ mg肝蛋白）并不是限制抗-HBc抗体产生的原因。

二、血清HBeAg可激发7/16-5 TCR-Tg T细胞耐受

由于7/16-5 TCR-Tg小鼠中HBc/HBeAg特异性T细胞的比例较高（占53％的CD4+T细胞），在体外用HBc/HBeAgs 培养未接触抗原的脾脏T细胞会产生大量的IL-2和IFN-γ（图3）。p120-140（对应于HBcAg的120-140残基的合成肽）能被7/16-5 T细胞识别。分别在HBcAg、HBeAg或p120-140条件下，7/16-5×HBc双转基因小鼠的脾T细胞产生的IL-2和IFN-γ与TCR单转基因小鼠T细胞的产量相当。T细胞对HBcAg缺乏耐受，与7/16-5×HBc双转基因小鼠体内抗-HBc IgG抗体的自发产生相符。相比之下，7/16-5×HBe双转基因小鼠的脾T细胞在T细胞水平上具有**的耐受性，并且在使用HBc/HBeAg进行体外培养的过程中产生的T细胞细胞因子较少（图3）。除了细胞因子产生减少，相比于来自TCR单转基因小鼠的T细胞，来自7/16-5×HBe双转基因小鼠的T细胞还表现出HBc / HBeAg特异性增殖缺陷。此外，血清HBeAg在7/16-5×HBe双转基因小鼠中引起的T细胞耐受不是由于胸腺或脾脏中7/16-5 T细胞的克隆清除，而是一种无能。测定7/16-5×HBc×HBe三联转基因小鼠中T细胞产生的细胞因子，可以证明血清HBeAg诱导了7/16-5 T细胞对HBc/HBeAg的特异性耐受，这与在7/16-5×HBe双转基因小鼠中观察到的特异性耐受程度相同（图3）。

因此，分泌的HBeAg（而非细胞内HBcAg）能引起7/16-5 T细胞的耐受/无能，血清HBeAg在T细胞水平通过这种方式下调7/16-5×HBc×HBe三联转基因小鼠的自发抗-HBc血清转换。此外，体内激活的7/16-5 T细胞介导7/16-5×HBc双转基因小鼠的肝损伤，但是在7/16-5×HBc×HBe 三联转基因小鼠中存在的血清HBeAg可**减轻肝损伤。因此，血清HBeAg的免疫调节作用不仅局限于**抗-HBc抗体的产生，还影响HBcAg特异性CD4⁺ T细胞介导的肝损伤。这些结果表明，分泌形式的核蛋白在患者体内的功能是作为**的T细胞耐受原，下调宿主对细胞内表达的HBcAg的免疫应答。

图3. 血清HBeAg 在7/16-5 T细胞中引起体内耐受/无能。用HBc/HBeAgs（1.0μg/mL）培养7/16-5 TCR单转基因、7/16-5×HBc双转基因、7/16-5×HBe双转基因或三联转基因小鼠的未接触抗原的脾细胞（5×10⁶ /mL），分别在第2天和第4天检测培养上清液中产生的IL-2和IFN-γ细胞因子。每只小鼠体内抗-HBc IgG抗体血清滴度均已标示。数据来自单只小鼠，至少代表三次独立实验。

三、在7/16-5 TCR-Tg T细胞中诱导T细胞耐受/无能取决于激活状态并且可逆

为了评估另一种模型中血清HBeAg调节对HBcAg的免疫应答的能力，将7/16-5供体T细胞分别过继转移至HBcAg-Tg、HBeAg-Tg或HBc/HBe双转基因受体小鼠的转移实验。将初始脾细胞（30×10⁶）从7/16-5 TCR-Tg供体小鼠过继转移至清除了T细胞的HBeAg-Tg受体小鼠中，未产生抗-HBe抗体，表明在这种情况下血清HBeAg对7/16-5 T细胞没有免疫原性（图4）；将数量相同的初始7/16-5供体脾细胞过继转移至清除T细胞的HBcAg-Tg受体小鼠中，在2-4周内受体小鼠产生高滴度的（1：100000终点稀释）、包含所有IgG亚型的抗-HBc抗体；而将初始的7/16-5供体脾细胞过继转移到HBc/HBeAg双转基因受体小鼠中后，仅有很少的抗-HBc抗体产生，为HBcAg单转基因受体小鼠产生量的0.2％（图4）。由此可见，除了非免疫原性外，血清HBeAg还可以使转移的7/16-5 T细胞耐受，不再介导HBc/HBeAg-Tg受体小鼠的抗-HBc血清转换。该结果与前面观察到的7/16-5×HBc×HBe三联转基因小鼠中没有自发的抗-HBc血清转换得结果相符（图1）。在过继转移7/16-5 T细胞后，HBc/HBe双转基因受体小鼠中低水平的血清HBeAg（10 ng/mL）也会减少抗-HBc抗体的产生（图4）。血清HBeAg在T细胞水平上**抗-HBc血清转换，因为转移的7/16-5 T细胞未能在HBe单转基因和HBc/HBe双转基因受体小鼠脾脏培养物中产生抗原特异性IL-2，而HBc单转基因受体脾培养物中细胞因子的产生活跃。同样，仅在HBc单转基因受体脾培养物中检测到了抗-HBc/e IgG抗体的产生。而所有Tg受体小鼠脾脏培养物均产生抗-HBc IgM抗体，且HBc×HBe双转基因受体脾细胞中的抗-HBc IgM抗体产生增加。这一结果与7/16-5×HBc×HBe三联转基因小鼠脾细胞体外产生的抗-HBc IgM抗体水平升高相一致。

图4. 诱导7/16-5 T细胞耐受/无能取决于T细胞的活化状态，并且可逆。将来自7/16-5 TCR Tg小鼠的，含有约3×10⁶ TCR⁺ CD4⁺ T细胞的供体脾细胞（30×10⁶）过继转移到CD4 / CD8清除的HBcAg或HBeAg单转基因，和HBc/ HBeAg双转基因受体小鼠中（每组三只受体小鼠）。供体脾细胞包含初始7/16-5 T细胞、使用p120-140（1.0μg/mL持续3天）体外预激活的7/16-5 T细胞，或从7/16-5×HBe双转基因小鼠提取的7/16-5 T细胞。转移后第2和第4周，给受体小鼠取血，并通过ELISA测定抗-HBc抗体的总IgG和IgG亚型。在用初始7/16-5 T细胞（第1组）过继转移的HBeAg-Tg受体小鼠中，测定了抗-HBe IgG抗体。对每组三只受体小鼠的合并血清进行总抗-HBc IgG抗体测定和IgG分型。

实验通过转移天然7/16-5供体脾细胞进行。将预激活的7/16-5供体脾细胞（即用p120-140培养）转移到HBc/e双转基因受体中，与转移初始脾细胞相比，体内产生的抗-HBc抗体增加到50倍（1：10,000滴度）（图4）。因此，活化的7/16-5 T细胞对受体中血清HBeAg诱导的耐受较不敏感。为了确定7/16-5×HBe双转基因小鼠中7/16-5 T细胞的无能状态是否可逆，将双转基因供体中提取的脾细胞也转移到HBcAg或HBc/HBe双转基因受体中。转移到HBc / HBe 双转基因小鼠体内几乎不会产生抗-HBc抗体，而转移到HBc单转基因小鼠中则会导致抗-HBc抗体的产生（1：10,000滴度）（图4）。转移到HBc-Tg受体中的无能的7/16-5供体T细胞诱导产生的抗-HBc抗体水平是初始7/16-5供体T细胞对应水平的10%，特定的IgG亚型水平仍为阳性，表明体内暴露于血清HBeAg的7/16-5 T细胞的耐受状态至少可在没有耐受原（即HBeAg）的情况下逆转或发生改变。在该系统中，HBeAg介导的T细胞耐受是非清除性的，并且在没有耐受原（HBeAg）的情况下是可逆的，因此将其描述为体内无能或适应性耐受。

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