扁豆凝集素填料LCA/LcH Lens culinaris lectin的应用

        凝集素（Lectin）是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故名凝集素。常用的为植物凝集素（Phytoagglutin，PNA），通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A（Conconvalina，ConA）、麦胚素（Wheat germ agglutinin，WGA）、花生凝集素（Peanut agglutinin，PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）等，凝集素是它们的总称。

通过盐析法、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析一系列操作对提取物进行分级分离，筛选富集对H5N1具有**微中和活性的组分，通过电泳发现为包含五种肽段的寡聚蛋白，质谱分析显示该蛋白质为扁豆凝集素（FRIL）。已有研究表明扁豆凝集素单体具有一个糖结合结构域，但在溶液中的状态未得到确定，综合利用多角度光散射、动态光散射、电镜复染，发现扁豆凝集素为四聚体结构。

进一步在体外定量测定了扁豆凝集素的抗病毒活性，空板减少试验与微中和试验显示PRNT50与EC50约0.7ug/Ml。利用11种流感毒株测定中和谱，发现除实验室菌株A，扁豆凝集素能以纳摩尔水平**不同亚型毒株。研究者通过鼻腔给药在小鼠体内评估凝集素的作用，凝集素抗病毒活性表现剂量依赖，高剂量给药能够明显延长存活时间甚至保护免受感染。

扁豆凝集素抗病毒活性

扁豆凝集素是已知的甘露糖/葡萄糖特异性凝集素，但关于扁豆凝集素与复杂糖基化的结合机制还有待了解。研究者将接种流感病毒的鸡胚进行α-甘露糖酶**剂并在回收时利用切割高甘露糖的内切糖苷酶处理，纯化后利用串联质谱、免疫印迹分析。

 结果发现扁豆凝集素主要结合流感病毒血凝素，而且主要结合复合型糖链而不是高甘露糖链，这与其他凝集素有很大不同。为了探明这现象背后的机制，研究者利用荧光探针标记的扁豆凝集素，发现与1,3或1,4岩藻糖基化N乙酰葡萄胺的复合型糖链结合较好。

凝集素结合糖链

进一步分析了扁豆凝集素的抗病毒机制,竞争性微中和试验发现甲基甘露糖苷和葡萄糖能够**其中和作用，证实了抗病毒中和效应依赖于糖结合功能。细胞用扁豆凝集素、流感病毒依次分开处理，不能**中和病毒感染，说明扁豆凝集素**病毒进入，必须直接结合病毒粒子才能发挥作用。流感病毒侵入细胞主要是吸附、内吞、脱壳、核转运这几个步骤，通过血凝**试验发现扁豆凝集素不能**病毒的吸附，研究者通过低温减慢病毒内吞入胞，使病毒吸附在细胞上，加入扁豆凝集素后观察到明显的中和效果，而在常温下病毒发生内吞后无法发挥作用，因此凝集素作用于吸附与内吞之间的过程。利用病毒核蛋白抗体免疫荧光示踪病毒入胞过程，发现凝集素处理组导致病毒滞留在核周区，通过内体/溶酶体染色显示病毒停留在晚期溶酶体内，凝集素在溶酶体仍能保持活性，可能发挥阻止病毒核转运的作用。进一步研究者发现核蛋白免疫荧光表现为大颗粒，且随着凝集素浓度增加颗粒逐渐变大，推测是凝集素与病毒颗粒间形成多价交联，聚集成团，从而发挥抗病毒作用。

wyf 03.30