聚苯乙烯微球ps表面抗体取向偶联的一般方法和原理

纳米探针已经在体外诊断领域得到了广泛的应用。然而在一般方法中，抗体通常是方向随机地吸附或偶联在纳米颗粒载体上，其抗原识别位点容易被占用或受到空间位阻的影响，导致纳米探针对抗原的特异性结合能力降低。为了改善抗体取向，使更多抗原结合位点充分暴露，研究者们提出了一系列新方法，代表性的技术包括利用抗体特殊位点（如Fc端寡糖链、铰链区二硫键）、引入夹层蛋白（如蛋白A、蛋白G、蛋白L）、分子印迹、抗体融合His-tag等。这些方法通常操作步骤比较复杂，成本较高，或需要对抗体改性，或需要引入新的组分，不易向实际应用中转化。

开发了一种简单的抗体取向结合在聚苯乙烯纳米颗粒表面的方法，即基于大家熟悉的EDC/Sulfo-NHS交联法，调整抗体和载体纳米颗粒的反应pH，并将这一条件下制备的探针用于心肌肌钙蛋白I 侧向免疫层析检测。结果表明，抗体结合量和结合取向以及抗原检测灵敏度都得到了**提高。虽然调节pH值是优化抗体结合常用的手段,但本文次深入探讨了该手段增强抗体取向的机制,并揭示了抗体密度、电荷分布和亲疏水性的重要性，物理吸附和化学偶联速度以及其他因素对抗体取向的影响。当pH降至略低于抗体等电点时，一方面，抗体的电荷分布和亲疏水区域分布更有利于其以“tail-on”取向；另一方面，抗体和载体间化学交联速度减缓，提供了更长的窗口时间，使抗体在纳米颗粒表面微环境的影响下更充分地调节取向。该方法提高抗体结合量的意义还在于，当抗体结合密度足够高时，抗体能够垂直紧密排列在载体表面，使探针结构更加有序和稳定。

图1 荧光免疫层析测定cTnI，探针制备时抗体投料量: (A) 50μg; (B) 200μg；(C) 抗体的三个维度尺寸

图2 (A) IgG1小鼠单克隆抗体(1IGY)的三维晶体结构。左上角:前视图;右上角:侧视图;左下角:俯视图;右下角:底部视图。碱性和酸性氨基酸基团分别用蓝色和红色标记。(B) Fab 2和Fc片段上碱性和酸性氨基酸的数量。(C)(Fab)2和Fc片段在不同pH下的净电荷量，忽略保守的糖链，电荷分布与pI的实测值不完全一致。

图3 pH对抗体取向偶联的影响及机制

这一简单、实用的方法适用于优化各种IgG型抗体的取向。充分探讨在化学交联过程中影响抗体取向的因素，也有助于更好地指导我们调节实验条件，从而构建更高性能的探针，从而实现高性能的体外诊断试剂开发。

wyf 04.12