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单克隆抗体OX26修饰丹酚酸B/黄芩苷纳米脂质载体实验研究

发布时间：2021-05-25 作者：axc 分享到：

〖要点一〗OX26-Sal B/BA-NLC的制备与评价

（1）SalB/BA-NLC的制备：采用乳化-固化法制备OX26-Sal B/BA-NLC。精密称取Sal B提取物3.5 mg，加入2 mL去离子水溶解，并称取Myrj 52 300 mg加入到9 mL去离子水中，水浴74 ℃溶解。在磁力搅拌下，将溶解完全的Sal B水溶液加入到Myrj52中，混合均匀，共同构成水相。称取BA提取物1.5 mg并溶于2 mL无水乙醇中，溶解完全后，加入50 mg卵磷脂，使二者混合均匀；另外称取Compritol 888 ATO 50mg、Miglyol 81220 mg以及适量的mPEG-MAL与mPEG-OH，加1 mL氯仿使之溶解，并将乙醇溶液与氯仿溶液合并，混匀，构成油相。保持水相在74 ℃的水浴中磁力搅拌，随之将混合好的油相滴入到水相中。待体系澄清时，降低转速，继续搅拌至总体积的1/3，冰水浴2 h。

（2）OX26的硫醇化：采用Traut’s试剂对单克隆抗体进行巯基化[19]。将抗体OX26置于0.15 mol/L硼酸钠/0.1 mmol/L EDTA缓冲液（pH 8.5）中。混合均匀后，加入Traut’s试剂，加入量根据OX26与2-iminothiolane物质的量比为1∶40计算获得。磁力搅拌下，冲氮、避光、室温反应1 h。将反应后的抗体经HitrapTM脱盐柱洗脱分离，洗脱液为0.01mol/L的HEPES缓冲液（pH 7.0）。

（3）OX26与Sal B/BA-NLC的连接：将上述制得巯基化的OX26与Sal B/BA-NLC混合，按照Maleimide与巯基比为3∶1进行混合。混匀后将其放置在避光条件下，充氮，磁力搅拌8 h。反应后，以0.01 mol/L的PBS缓冲液（pH 7.4）为洗脱液，过SepharoseCL-4B柱以除去游离的蛋白OX26，即得抗体修饰后的纳米粒混悬液体系OX26-Sal B/BA-NLC。

〖要点二〗OX26-Sal B/BA-NLC中Sal B及BA的含量测定方法及包封率测定

（1）色谱条件：色谱柱为Diamond Dikmaods C18柱（200mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-乙腈- 0.2%磷酸水溶液（22.5∶22.5∶55）；检测波长280 nm；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL。

（2）标准曲线的绘制：分别精密称取Sal B对照品和BA对照品适量，甲醇溶解并定容，作为储备液。取适量储备液，加甲醇配制成SalB质量浓度为1.06、6.10、10.16、28.45、71.12 μg/mL，BA质量浓度为0.72、4.32、7.20、20.16、50.40 μg/mL的混合对照品溶液。按照上述色谱条件，进样20 μL，记录其峰面积，以峰面积（A）对质量浓度（C）做图。得到Sal B的回归方程为A＝23 231 C－ 6 393.4，r＝0.999 9；BA的回归方程为A＝72 709 C－11 437，r＝0.999 9。

（3）精密度考察：选取低、中、高3个质量浓度（1.06、10.16、28.45 μg/mL）的混合对照品溶液1 d内重复测定3次，计算日内RSD；连续测定3 d，计算日间RSD。结果显示，Sal B和BA的日内、日间RSD均小于2%，精密度符合方法学要求。

（4）包封率的测定：实验选用超滤离心法测定其包封率。将0.2 mL纳米制剂加去离子水稀释至3.0mL，置于超滤离心管中，5000 r/min离心20 min。离心后取外管中的样品进行HPLC测定，即为W游。另取0.2 mL纳米制剂，加入甲醇2.8 mL超声，5 000 r/min离心20 min，经0.22 μm滤膜滤过，取续滤液经HPLC测定，即为W总。计算Sal B及BA的包封率［包封率＝(W总－W游)/W总，其中W游为载药NLC中游离**质量，W总为载药NLC中总的**质量］。

结果显示，Sal B/BA-NLC中Sal B与BA的包封率分别为（99.79±0.19）%和（89.60±3.53）%，OX26-SalB/BA-NLC中Sal B与BA包封率分别为（95.77±2.42）%和（54.93±5.00）%。

〖要点三〗形态观察：利用TEM对Sal B/BA-NLC和OX26-Sal B/BA-NLC进行形态观察。分别取适量的Sal B/BA-NLC和OX26-Sal B/BA-NLC置于铜网上，室温干燥后，用2%的磷钨酸对其染色，再次自然干燥。采用TEM观察并摄制照片，见图1。结果显示，Sal B/BA-NLC和OX26-Sal B/BA-NLC粒子多呈圆形，分散较好，且大小均匀。