产品名称：Cholera Toxin Subunit B, CF®488A的表征与功能验证

1. 结构表征与化学合成

CTB核心结构：CTB为五聚体环状结构（分子量约55 kDa），由5个相同亚基通过氢键和疏水作用结合，特异性识别细胞膜脂筏中的GM1神经节苷脂（如神经元、树突细胞表面）。其无毒性，但可触发网格蛋白介导的内吞作用，实现逆行神经元示踪。

CF®488A特性：绿色荧光染料（激发/发射波长490/515 nm），分子量约710 Da，具有高亮度、良好光稳定性（优于FITC/Alexa Fluor 488）及pH不敏感性（5-9范围稳定），电荷中性特性减少非特异性结合。

偶联化学：通过NHS酯与CTB赖氨酸ε-氨基形成稳定酰胺键，保留CTB天然构象和GM1结合能力。反应条件需避光、pH 7.5-8.5，避免DBCO光降解或酸碱副反应。

2. 光谱学与结构验证

光谱分析：UV-Vis/荧光光谱确认激发/发射波长（490/515 nm），荧光强度与标记密度成正比，用于定量分析。圆二色谱（CD）监测CTB二级结构是否因偶联改变，确保生物活性保留。

结构表征：SDS-PAGE显示约55 kDa目标条带，Western blot验证CTB特异性；质谱（MS）或NMR确认偶联位点及分子量增加；分子筛层析（SEC）分离游离染料与标记产物，提升纯度（≥95%）。

3. 功能验证与生物活性

细胞结合实验：流式细胞术或荧光显微镜观察CTB-CF488A与GM1的特异性结合，如神经元膜标记、脂筏分布及内吞过程追踪。冷PBS洗涤终止反应后，FITC/GFP通道（515 nm）检测荧光信号。

逆行运输与成像：在神经元中，CTB-CF488A被轴突末梢摄取后，沿微管逆向运输至胞体，实现神经通路示踪。多色成像可与CF568/CF647联用，避免交叉干扰。

生物活性测试：MTT法评估细胞毒性，确保无毒性；抗凝血活性实验（如APTT/TT）验证肝素结合功能保留；动物体内实验（如肌肉注射大鼠腓肠肌）观察荧光信号在神经元胞体、树突的分布，最佳观察时间为注射后3-7天。

疫苗佐剂应用：CTB作为黏膜疫苗佐剂，刺激IL-1等细胞因子分泌，增强抗原呈递细胞（APC）功能。

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