PBA-Glu-PBA嵌段共聚物在脑系统中的应用

D-葡萄糖(Glu)是体液中必需的能量来源。生理和病理事件中Glu浓度的变化提示可能的生物学功能障碍。制造可靠的Glu传感器，特别是涉及大脑功能和神经传递的传感器，一直是来自不同学科的研究人员的长期目标。目前Glu选择性探针可分为两类:一类是基于利用葡萄糖氧化酶(GOx)水解产物监测Glu的策略。另一种方法是将醇与PBA在水介质中可逆结合来检测Glu。近年来，依据分子结构设计或GOx的串联催化反应设计的与Glu特异反应的探针都依赖于在复杂样品中添加探针和传感Glu，这就增加了立体异构体干扰的可能性。为了克服这个问题，科学家做出了很多努力，比如用Glu作为连接剂来引起染料的聚集，或者设计对Glu更具选择性的分子结构，但是由于Glu选择性传感探针的合成复杂且困难以及Glu即使被识别也难以分离等原因，Glu的选择性和可控性检测并不容易实现。受“钓鱼”概念—从一个复杂的矩阵中捕获的配体的启发，在Glu传感探针的构建中提出 “选择性捕获和可控检测”的策略，设计了一种直接靶向的热纳米反应器，该反应器包含聚合物链硼酸单元作为捕获配体和用于调节传感效率的热响应阀。

匹配的良好亲和力和高选择性需要将识别元素硼酸单元立体地放置在适当的位置，并且它们的方向对于优化捕获Glu非常重要。受1,2-二醇与PBA可逆共价结合的启发，提出了一种新机制，该机制基于良好的嵌段共聚物聚马来酸酐苯乙烯-N-异丙基丙烯酰胺-(4-氨基苯基)硼酸[P(MAn-St-NIPAm-PBA)]对于Glu的靶向性。该共聚物通过使用可逆加成-裂解链转移法的活性/控制聚合方法实现。聚合是通过使用引发剂和链转移剂进行的。然后通过沉淀和过滤获得产物PS-MAn，再利用其作为大分子链转移剂，逐步实现P(MAn-St-NIPAm)和P(MAn-St-NIPAm-PBA)的合成。一系列的PBA单元在嵌段共聚物上修饰，自组装后PBA单元在胶束表面紧密分布，相邻的PBA单元可以在“正确”的方向与不同的羟基反应，以确保PBA-Glu-PBA复合物的形成。而其他非Glu糖由于不同的立体结构，不与P(MAn-St-NIPAm-PBA)发生反应。与水介质中的游离PBA相比，P(MAn-St-NIPAm-PBA)可以选择性捕获Glu。且捕获并从复杂样品中分离出Glu后，Glu的pH释放和纳米反应器中热响应控制的梯度酶反应可对Glu进行可控检测。由于 “选择性捕获”步骤消除了Glu立体异构体的可能干扰，因此用于Glu检测的串联催化反应具有良好的灵敏度和选择性。此外，热响应控制的酶反应将为Glu的可控检测提供新的途径。

图1.纳米反应器的设计。(A) P(MAn-St-NIPAm-PBA)中PBA立体放置从而实现Glu选择性捕获。(B)鼠脑微透析过程示意图。(C)中空纳米反应器对Glu的捕获和释放过程。(D)以GOx酶和肌红蛋白（Myo）为催化剂的中空纳米反应器，通过温度变化对大鼠脑内Glu进行监测。

在中空P(MAn-St-NIPAm-PBA)纳米反应器成功形成后，通过测试其直径在25-40 ℃之间的变化来研究它的热响应渗透阀。从25 ℃加热到40 ℃后，空心纳米反应器的尺寸从21.0 nm减小到16.0 nm。此外，纳米反应器的直径在冷却后恢复到原来的直径。这种行为至少在五个周期内是可重复的。结果表明，纳米反应器中的可调阀可以通过改变温度来控制酶的活性。为了确定空心纳米反应器的形貌，用透射电子显微镜（TEM）进行测量。TEM显示，合成的空心P(MAn-St-NIPAm-PBA)纳米反应器的总体尺寸约为80-100 nm，为规则的球形，壳厚约为10-15 nm。酶嵌入前后纳米反应器的原子力显微镜（AFM）图像表明，纳米反应器自组装成高28.6 nm、直径108.0 nm的胶束，与TEM结果相似。酶嵌入纳米反应器后，纳米反应器的AFM图像显示其为高度32.1 nm、直径123.0 nm的完整球体，略大于空心球形胶束。这些结果证明P(MAn-St-NIPAm-APBA)成功地形成了胶束型纳米反应器。根据温度调节的纳米反应器的阀可以控制酶和底物的渗透性。

图2.(A)纳米反应器的热响应特性。(B) (D)空心P(MAn-St-NIPAm-APBA)纳米反应器的TEM和AFM图像。(C) (E)含GOx的P(MAn-St-NIPAm-APBA)纳米反应器的TEM和AFM图像。

与25 ℃下的酶反应相比，在较高温度（40 ℃）下的游离酶活性略有增加。证明了GOx和Myo两种酶的串联催化反应可用于Glu的评价。在纳米反应器中嵌入GOx和Myo催化剂，随后添加底物（Glu和愈创木酚）。使用GOx填充和Myo填充纳米反应器对Glu进行选择性捕获和可控传感。Glu可以被高度选择性地捕获并从复杂的样品中提取，且通过调节pH值（4.0到6.0）释放。随后，将GOx填充和Myo填充纳米反应器应用于不同温度（25或40 °C）下的酶活性研究。在40 °C时，纳米反应器的阀门为关，因此未检测到GOx和Myo催化剂的酶产物，这表明这些酶在纳米反应器中被完全屏蔽，Glu和愈创木酚不能进入纳米反应器并被GOx和Myo水解。

图3.采用GOx和Myo填充纳米反应器进行Glu的选择性捕获/释放和原位可控检测。

一般来说，对生理上重要物种的高选择性传感方法尤为重要。因此将该策略应用于监测生物脑中Glu。该方法采用Glu初始化的串联反应，并可通过醌的紫外强度变化来测量Glu。为了测定大鼠大脑中的Glu，制备了不同浓度的Glu溶液，并添加了含GOx的纳米反应器。在25 °C（pH 6.0）下孵育5分钟后，分离含有GOx的纳米反应器并转移到pH 4.0的缓冲溶液中。pH值的变化可以降低纳米反应器表面PBA靶向基团的Glu量。然后，在25 ℃下添加含有Myo和愈创木酚的纳米反应器溶液。将所得混合物在40 ℃（pH 4.0）下孵育5分钟，然后检测紫外光谱，醌强度在470 nm处达到峰值，并随着Glu浓度在0.30-10.0 mM范围内线性增加的变化而增加，检测限为0.20 mM，这表明该方法可用于大鼠脑样品中的Glu传感，且纳米反应器在Glu检测中表现出良好的选择性和稳定性。大鼠全脑缺血(静息期)术前2小时收集大鼠脑微透析液标本。术后20分钟Glu水平略有下降，术后2小时Glu水平下降约25.0 %，与以往报道一致，再次说明纳米反应器材料和“选择性捕获和可控检测”策略对大鼠脑微透析液样品中Glu的分析是非常有选择性的。

纳米反应器的温度响应与Glu的线性关系。(B)静息、缺血生理条件下大鼠脑微透析液样品中Glu浓度的变化。

利用GOx和Myo催化剂的靶向性和串联催化反应成功地证明了热响应纳米反应器在大鼠脑内Glu高选择性检测中的应用。通过应用热敏特性以及Glu与嵌段共聚物上立体放置的双硼酸之间的结合反应，使纳米反应器将成为大鼠脑微透析液样品中Glu传感的可靠而的材料

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