文献：具有PD-1膜蛋白的融合混合细胞外囊泡用于胞质货物运输

链接：https://www.mdpi.com/2072-6694/14/11/2635

作者：石川拉贺†奥西德，吉田章介‡，泽田新一，佐佐木义弘和秋吉一成*

节选：

材料

杆状病毒表达系统中常用的秋粘虫Spodoptera frugiperda的Sf9昆虫细胞系购自Invitrogen公司（美国加利福尼亚州沃尔瑟姆）。HeLa细胞购自JCRB Bank（日本研究生物资源保藏中心，日本大阪）。 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DOPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸- L -丝氨酸 (DOPS)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- N -(菁 5) (Cy5-DOPE)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- N -(7-硝基-2-1,3-苯并恶二唑-4-基) (NBD-DOPE) 和 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- N -(丽丝胺罗丹明 B 磺酰基) (Rho-DOPE) 均购自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA)。

脂质体制备

将DOPC、DOPS、NBD-DOPE、Rho-DOPE和Cy5-DOPE以不同的摩尔比在玻璃微管中的氯仿中混合。在流动的氩气下蒸发溶剂，形成脂质膜。将膜置于真空干燥器中过夜，以完全去除氯仿。加入250 µL缓冲液（20 mM CH3COOH/CH3COONa（pH 4.5）或10 mM Tris-HCl（pH 7.5））使膜水合，并在27 °C下孵育过夜。使用微型挤出机（Avanti Polar Lipids）将悬浮液挤出100 nm孔径的聚碳酸酯膜。使用磷脂C测试（Wako，日本大阪）测量脂质浓度。简而言之，磷脂酶D和胆碱氧化酶从磷脂样品中产生过氧化氢。产生的过氧化氢在过氧化物酶的作用下促进N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)与4-氨基安替比林发生缩合反应，生成蓝色染料，通过测定该染料的吸光度，从而测定样品中的磷脂浓度。

成像流式细胞术

PD-1 EVs 用 5- 或 6-（ N-琥珀酰亚胺氧羰基）荧光素 3′，6′-二乙酸酯 (CFSE)染色。将 CFSE 添加到 PD-1 EVs 悬浮液中，使其终浓度为 62.8 µM，然后在 37 °C 下孵育 30 分钟。为了去除游离的 CFSE，使用 100,000 NMWL Amicon 超离心过滤器（Merck Millipore，美国马萨诸塞州伯灵顿）清洗标记的 PD-1 EVs。以 100:100:1 的 DOPC、DOPS 和 Cy5-DOPE 摩尔比制备脂质体。将 CFSE PD-1 EVs（5 µg/mL）和 Cy5 脂质体（1 µM）在酸性或中性条件下混合，并在 27 °C 下孵育 30 分钟。通过加入与反应溶液等体积的pH 7.5缓冲液终止融合反应。PD-1杂合胞体外膜通过100nm孔径的膜挤出。使用ImageStream x MkII（Merck Millipore）采集PD-1杂合胞体外膜的多光谱图像。激光功率设置为*大值（488nm：200mW；642nm：150mW；785nm（侧向散射）：70mW）。荧光信号在通道2（CFSE）或通道5（Cy5）中收集。通道1和通道6分别设置为明场和侧向散射。在40倍放大倍数下采集10,000个粒子的荧光强度，并使用IDEAS 6.2软件进行分析。

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