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Cy5-DOPE在细胞膜荧光示踪中的应用与特性分析
发布时间:2025-07-09     作者:kx   分享到:

文献:具有PD-1膜蛋白的融合混合细胞外囊泡用于胞质货物运输

链接:https://www.mdpi.com/2072-6694/14/11/2635

作者:石川拉贺†奥西德,吉田章介‡,泽田新一,佐佐木义弘和秋吉一成*

节选:

材料

杆状病毒表达系统中常用的秋粘虫Spodoptera frugiperda的Sf9昆虫细胞系购自Invitrogen公司(美国加利福尼亚州沃尔瑟姆)。HeLa细胞购自JCRB Bank(日本研究生物资源保藏中心,日本大阪)。 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DOPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸- L -丝氨酸 (DOPS)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- N -(菁 5) (Cy5-DOPE)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- N -(7-硝基-2-1,3-苯并恶二唑-4-基) (NBD-DOPE) 和 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- N -(丽丝胺罗丹明 B 磺酰基) (Rho-DOPE) 均购自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA)。

脂质体制备

将DOPC、DOPS、NBD-DOPE、Rho-DOPE和Cy5-DOPE以不同的摩尔比在玻璃微管中的氯仿中混合。在流动的氩气下蒸发溶剂,形成脂质膜。将膜置于真空干燥器中过夜,以完全去除氯仿。加入250 µL缓冲液(20 mM CH3COOH/CH3COONa(pH 4.5)或10 mM Tris-HCl(pH 7.5))使膜水合,并在27 °C下孵育过夜。使用微型挤出机(Avanti Polar Lipids)将悬浮液挤出100 nm孔径的聚碳酸酯膜。使用磷脂C测试(Wako,日本大阪)测量脂质浓度。简而言之,磷脂酶D和胆碱氧化酶从磷脂样品中产生过氧化氢。产生的过氧化氢在过氧化物酶的作用下促进N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)与4-氨基安替比林发生缩合反应,生成蓝色染料,通过测定该染料的吸光度,从而测定样品中的磷脂浓度。

Cy5-DOPE

成像流式细胞术

PD-1 EVs 用 5- 或 6-( N-琥珀酰亚胺氧羰基)荧光素 3′,6′-二乙酸酯 (CFSE)染色。将 CFSE 添加到 PD-1 EVs 悬浮液中,使其终浓度为 62.8 µM,然后在 37 °C 下孵育 30 分钟。为了去除游离的 CFSE,使用 100,000 NMWL Amicon 超离心过滤器(Merck Millipore,美国马萨诸塞州伯灵顿)清洗标记的 PD-1 EVs。以 100:100:1 的 DOPC、DOPS 和 Cy5-DOPE 摩尔比制备脂质体。将 CFSE PD-1 EVs(5 µg/mL)和 Cy5 脂质体(1 µM)在酸性或中性条件下混合,并在 27 °C 下孵育 30 分钟。通过加入与反应溶液等体积的pH 7.5缓冲液终止融合反应。PD-1杂合胞体外膜通过100nm孔径的膜挤出。使用ImageStream x MkII(Merck Millipore)采集PD-1杂合胞体外膜的多光谱图像。激光功率设置为*大值(488nm:200mW;642nm:150mW;785nm(侧向散射):70mW)。荧光信号在通道2(CFSE)或通道5(Cy5)中收集。通道1和通道6分别设置为明场和侧向散射。在40倍放大倍数下采集10,000个粒子的荧光强度,并使用IDEAS 6.2软件进行分析。

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