生物素标记猪去氧胆酸（Biotinylated Hyodeoxycholic Acid）：合成、特性与应用研究

一、引言

胆汁酸是胆固醇代谢的主要产物之一，在脂类消化吸收、肠道菌群调节及信号转导中发挥重要作用。猪去氧胆酸（Hyodeoxycholic Acid, HDCA） 是一种在猪胆汁中含量较高的二羟基胆汁酸，具有独特的空间构型与疏水-亲水分布特征，在肠道吸收及胆汁酸受体激活中表现出特殊的生物学活性。

将 HDCA 与生物素（Biotin）分子偶联，可获得生物素标记猪去氧胆酸（Biotinylated HDCA）。这种化学修饰不仅保留了 HDCA 的胆汁酸性质，还赋予其与亲和素（Avidin/Streptavidin）体系的高特异性结合能力，从而实现了对胆汁酸相互作用的可视化、分离与高灵敏检测。

二、分子结构与特性

1. 猪去氧胆酸（HDCA）特性

HDCA 属于 C₂₄ 胆汁酸，骨架由甾体四环结构（环 A-D）构成，C-3 与 C-6 位带有羟基，C-17 位延伸出含羧基的脂肪链。其疏水性较强，但在碱性条件下羧基离子化，可溶于水相环境。

2. 生物素（Biotin）特性

生物素是一种含有 双环咪唑烷酮环与戊酸侧链 的维生素（维生素 H/B₇），能够与亲和素或链霉亲和素以 Kd≈10⁻¹⁵ M 的超高亲和力结合，结合过程几乎不可逆。

3. 生物素标记优势

通过在 HDCA 上引入生物素标签，可以利用亲和素体系进行固定化、检测或纯化。这种改造尤其适合研究胆汁酸-受体相互作用、肠道菌群代谢以及胆汁酸转运蛋白活性。

三、合成策略

生物素标记 HDCA 的核心是将 HDCA 分子上的羧基或羟基与生物素的可偶联位点连接。典型合成路线如下：

1. 羧基活化法（EDC/NHS 途径）

步骤：

在无水有机溶剂（如 DMF、DMSO）中，使用 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）活化 HDCA 的羧基。

加入 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）生成 NHS 酯。

将氨基修饰的生物素（Biotin-NH₂）引入，形成稳定的酰胺键偶联物。

优点：反应条件温和，产率高，偶联位点明确。

2. 羟基修饰法

若选择在 C-3 或 C-6 羟基位置引入生物素，可先将生物素衍生化为活性碳酸酯（如 Biotin-NHS carbonate），再与 HDCA 发生酯化反应。这种方式保留了 HDCA 羧基，适合需要维持胆汁酸性分布的研究。

3. 接头分子（Linker）引入

为了减少立体位阻并提高结合效率，通常在 HDCA 与生物素之间加入 聚乙二醇（PEG）链段 或烷基链（如 C₆、C₁₂），形成 Biotin-PEGn-HDCA，提高在亲和素表面的可达性。

四、物理化学性质

分子量：约 700–1000 Da（取决于 linker 的长度）

溶解性：在有机溶剂（DMSO、DMF、乙醇）中良好，部分衍生物在 PBS 中可溶。

稳定性：干燥、避光、低温（–20 ℃）条件下稳定，水溶液中需短期使用以避免水解。

结合特性：与亲和素类蛋白结合迅速且牢固，可用于多轮洗脱实验。

五、生物医学应用

1. 胆汁酸受体研究

HDCA 是法尼醇 X 受体（FXR）与膜型胆汁酸受体（TGR5）的天然配体之一。通过生物素标记，研究者可利用 生物素-亲和素磁珠 富集结合蛋白，解析受体与配体的结合位点与动力学。

2. 肠道菌群代谢分析

肠道菌群可对胆汁酸进行去羟基化、氧化还原等反应。生物素化 HDCA 可作为探针，追踪其在菌群代谢过程中的转化产物，通过亲和捕获与质谱联用分析代谢途径。

3. 胆汁酸转运蛋白（ASBT/OATP）功能检测

在细胞模型中，生物素标记 HDCA 可用于研究胆汁酸转运蛋白的底物特异性和转运速率，配合荧光或放射性标记实现多重检测。

4. 药物递送平台

HDCA 结构与细胞膜脂质的相互作用较强，可作为载体靶向肝脏与肠道。生物素化后，可利用亲和素修饰的纳米粒子或脂质体实现 受体介导的定向递送。

5. 分子成像

若进一步在亲和素上连接荧光探针或放射性示踪剂，生物素化 HDCA 可实现 体内胆汁酸分布与代谢的成像监测。

六、实验注意事项

反应条件控制：EDC/NHS 反应需在弱酸性至中性条件（pH 5.5–7.5）进行，以保证偶联效率。

纯化：可采用反相 HPLC 或凝胶过滤去除游离生物素和副产物。

检测：可通过质谱（ESI-MS, MALDI-TOF）确认分子量与偶联程度。

储存：干燥粉末需 –20 ℃ 避光保存，避免水分和强光。

七、优势与局限

优势

超高亲和力结合，易于捕获靶标

保留 HDCA 生物活性，可进行功能研究

化学合成可控，纯度高、批次稳定性好

局限

生物素化可能改变 HDCA 的疏水性与受体亲和性

在体内研究中，生物素标记可能影响胆汁酸的转运与代谢途径

八、未来发展方向

可切割连接

在 HDCA 与生物素之间引入可生物降解或光敏切割的 linker，实现标记后可逆释放，减少结构修饰对功能的影响。

多模态探针

结合荧光、磁共振或核医学示踪，实现多模态成像与功能分析。

结构优化

探索不同位置和链长的生物素修饰对 HDCA 生物活性的影响，开发更高特异性、更低干扰的探针。

九、结论

生物素标记猪去氧胆酸是一种兼具胆汁酸生物功能与超高亲和捕获能力的分子探针。通过化学偶联技术，将生物素的可识别性与 HDCA 的受体靶向性结合，可广泛应用于胆汁酸代谢研究、受体功能解析、肠道菌群作用机制探索以及药物递送系统设计。随着合成方法和检测技术的进步，这类探针在基础研究与临床转化中都具有广阔前景。

厂家:西安齐岳生物科技有限公司

用途:科研

温馨提醒:仅供科研，不能用于人体实验!