生物素化蛋白：原理、制备与应用研究

一、概述

生物素（维生素H，Vitamin B7）是一种小分子维生素，其分子量仅为244 Da，但与亲和素（Avidin）或链霉亲和素（Streptavidin）具有高的亲和力（Kd ≈ 10⁻¹⁵ M），几乎是已知强的非共价生物结合之一。这一特性被广泛应用于信号放大、定位检测、靶向递送与纳米材料功能化等领域。

通过将生物素修饰在蛋白质表面（即“生物素化”），可赋予蛋白“结合能力”，使其便于后续与链霉亲和素（SA）结合的系统对接，如磁珠纯化、荧光成像、免疫检测等。

二、生物素化蛋白的原理

2.1 生物素-亲和素结合系统特点

高亲和力（Kd < 10⁻¹⁵ M）

特异性强：可在复杂体系中实现准结合

耐高温、耐pH、耐变性：为稳定

结合位点清晰：1个亲和素可结合4个生物素分子

2.2 生物素修饰蛋白的目的

功能对接：与SA标记的磁珠、酶、荧光素等结合

可追踪：结合荧光、酶标后用于定量/成像

可纯化：实现靶蛋白从混合体系中选择性提取

可偶联：在诊断试剂盒、药物递送中作为识别界面

三、常用生物素化方法

3.1 非特异性共价标记法（化学修饰）

常见方式是使用NHS-活化的生物素衍生物与蛋白质的赖氨酸残基（—NH₂）反应：

试剂名称 反应基团 水溶性 用途

NHS-Biotin NHS酯 否 蛋白氨基标记（需DMSO溶解）

Sulfo-NHS-Biotin NHS酯 是 水溶性，更适合生理条件反应

NHS-PEGn-Biotin PEG间隔臂 是 提高空间位阻，减少功能障碍

反应条件：

蛋白浓度：1–2 mg/mL

缓冲体系：碳酸盐缓冲液（pH 8.3）或PBS（避免含Tris、叠氮、BSA）

反应时间：30分钟至2小时，4°C或室温

生物素添加比例：摩尔比 1:10–1:20（蛋白：生物素）

反应后通常通过透析、离心滤管（cut-off 10 kDa）、层析等方法去除多余生物素试剂。

3.2 酶催化标记法（位点特异性）

适用于需要精确定点标记的重组蛋白，例如：

（1）BirA酶系统

表达含有**Avi-tag（GLNDIFEAQKIEWHE）**的重组蛋白，经BirA催化在K残基上连接生物素，位点单一，标记高度一致。

（2）Sortase A / lipoic acid ligase（LplA）系统

基于酶催化N端或C端特定位点修饰，特异性高、适合体内标记。

3.3 亲和捕获式标记（非共价）

如直接将蛋白通过融合表达为亲和素融合蛋白（streptavidin fusion protein）或使用已标记生物素链的抗体、连接蛋白，进行复合体组装，不改变蛋白序列结构。

四、生物素化程度验证

4.1 HABA试剂法（定量）

HABA（4'-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid）与链霉亲和素结合形成有色络合物，生物素竞争结合后颜色消退，可用分光光度法检测：

波长：500 nm；

计算结合位点数、取代率；

适合常规蛋白（不适用于低浓度或强吸收蛋白）。

4.2 质谱 / 电泳 / Western blot（结合抗生物素抗体）

可检测蛋白是否成功标记，是否迁移位移或被特异性识别。

4.3 SA-磁珠或SA-ELISA验证结合功能

以功能性测试评估其与亲和素/链霉亲和素是否有效结合。

五、典型应用领域

应用方向 具体内容

免疫检测 生物素化抗体与SA-HRP/SA-FITC偶联，广泛用于ELISA、IFA、WB

细胞成像与示踪 生物素化配体/蛋白与Cy5-SA等结合，用于共聚焦、FACS检测

靶向药物递送 生物素修饰蛋白/抗体连接于纳米粒，通过SA桥接药物或成像探针

纯化捕获系统 生物素化蛋白结合SA磁珠/琼脂糖微珠用于选择性富集、纯化

组织工程与材料修饰 生物素-蛋白-表面构建用于细胞粘附、信号传导研究

六、注意事项与优化建议

问题 建议

蛋白活性降低 控制标记位点数量，使用PEG间隔臂生物素

难溶或聚集 使用Sulfo-NHS-Biotin避免疏水性NHS影响

游离生物素残留 必须透析/离心除去，以免干扰后续结合反应

交叉反应 控制体系中无BSA/甘氨酸/含胺化合物

非特异结合 添加Tween-20或封闭剂可改善背景问题

七、结语与展望

生物素化蛋白系统以其高度特异性、稳定性及灵活的连接能力，已成为现代生物检测、分子成像、靶向治疗和纳米构建的重要技术平台。未来，结合酶定点标记、生物正交反应、生物素类似物（如Desthiobiotin、Photobiotin），生物素化蛋白将在高通量检测、生物纳米装配、体内递送等方面继续扩展其应用边界。